11.1藥物ADME/T性質研究的內容 1 1 5 6 6 6 7 8 9 92.2.1MDCK細胞模型的基本特點 9 2.2.3MDCK單層細胞模型的評價 2.2.4MDCK細胞模型在藥物研究中的應用 2.3LLC-PK1細胞模型的基本特點及 3.2藥物轉運體與藥物相互作用研究的指導原則 4.3.1MDCK-MDR1細胞株的構建 株構建及評價 4.6Bcap37-MDR1細胞模型的構建及其評價 4.7多種轉運體蛋白共表達的轉基因細胞模型 5項目展望(個人看法) 圖1藥物在體內的轉運過程 1圖2一個新藥從研究開發到成功上市的基本過程 2圖3藥物研發歷程中導致失敗的原因分析 3圖4ADME模型在藥物研發過程中角色的轉變 3 5圖6Caco-2細胞單層模型 7 圖8SCI收錄的關于轉運體在藥動學/藥物相互作用方面的文章數量年年遞增16圖9機體主要器官藥物轉運體的功能及分布 圖10藥物轉運體細胞模型構建的一般策略 圖11LLC-PK1-BCRP單克隆細胞的活性鑒定——Hoechst33342染色法 表1MDCK細胞與Caco-2細胞的比較 表2ABC轉運體家族 表4藥物相互作用研究相關的轉運體 1藥物ADME/T研究的概述藥物代謝動力學(Pharmacokinetics)是研究藥物的體內過程及體內血漿等組織藥物濃度隨時間變化規律的一門學科(圖1所示)。ADME/T是近幾年發展起來的、全新的、在細胞水平上早期進行藥物的活性與吸收(Absorption)、分布 制藥公司年收入的20%用在新藥的研發上，全球每年在新藥上的投資超過300億美金(圖2所示)。Millionsofscreensforsolubility,stabi在先導化合物的篩選過程中，40%到60%的先導性質檢測中被淘汰。導致失敗率較高的原因主要有：商業性占5%;動物實驗毒性(Tox.)過大占11%;藥效不夠占30%;人體副作用過大占10%;藥物的ADME性質不佳學占39%(圖3所示)。全球72%的藥物研發費用被浪費在日益增長縱觀藥物發現的漫長歷史，藥物研究已經經歷了由盲目隨機的到有的放矢的、有傳統經驗性的向現代的科學性的研究方法的轉變。90年代藥物研究策略主要采用以生物活性為主導的篩選模式，藥物研究遵循“分子庫——活性篩選——傳統QSAR模型——ADME/PK研究——毒性研究——候程(按部就班的“循環式”):而如今的藥物研究則遵循“分子庫平行篩選 候選藥物”的平行過程(齊頭并進的“平行式”)。目前，國外制藥公司不僅在測定藥效的同時平行評價化合物的ADME/T性質，并且建立了體外高通量篩選ADME/T技術(圖4所示)。藥物早期ADME/T性質研究主要以人源性或人源化組織功能性蛋白質為“藥靶”,體外研究技術與計算機模擬等方法相結合，研究藥物與體內生物物理和生物化學屏障因素間的相互作用。藥物早期ADME/T顯示，隨著新策略和新技術的應用，因ADME/T問題而終止新藥開發的比例下下降為11%。床成功與否的關鍵(圖5所示)。目前世界公認的新藥研發三大平臺包括藥效學(組合化學)的發展，當代藥物探索(Drugdiscovery)研究要求采用高通量實圖5ADME/T模型在藥物研發中的價值貢獻批準105傳統的藥物動力學研究模式已經不能適應現代藥物研究的要求，體外高通量ADME/T結合計算機方法稱為當今藥物研究發展的趨勢。ADME/T構成了當代藥物化學研究十分重要的方面，并逐漸成為當代藥物發現策略的一部分。誠如Selick教授所言：“藥物的ADME/T性質將是今后藥物設計的首要原則中不可或缺的組成部分”。目前，一個新藥進入市場并不是十分有效的過程，其中90%以上已經進入臨床研究的藥物最終由于藥代動力學和藥效學因素(如生物利用度差、異常毒性、安全性評價不當以及藥物相互作用等)而功虧一簣。導致新藥發現如此低的成功率的一個重要原因與藥物發現和開發階段的動物實驗數據相關。由于在生理和致病過程中存在著種屬間差異性，因此，在藥物開發過程中使用的實驗動物往往是不可靠的，會給我們提供大量錯誤的信息。對于這樣的情況，人們已開發出基于人體細胞和組織的體外篩選法包括高通量篩選(HTS)和ADME/T進行藥物代謝研究，這對預測臨床前藥物的ADME/T性質和安全性是十分重要的。ADME/T細胞培養模型能在一定程度上模擬體內條件而被廣泛用在多種給藥系統中進行藥物吸收機制及轉運途徑等方面的研究，尤其是對蛋白質、多肽經過20多年的發展，目前已有很多基于組織水平和細胞水平的ADME/T體外模型用于藥物高通量的研究，比較成熟的有用于藥物吸收研究的Caco-2細胞漿蛋白結合模型和透血腦屏障模型等。2.1Caco-2細胞模型大量、快速篩選藥物的方法之一。其中，Caco-2細胞系來源于人類結腸腺癌，Caco-2細胞單層轉運模型是ADME/T的典型方法之一，也是被美國FDA批準的Caco-2細胞在普通培養條件下即可在有孔的多聚碳酸酯膜上自發的分化為腸上皮細胞單層，因此可以模擬體內小腸上皮細胞層。Caco-2細胞具有與小腸絨毛水解酶和各種營養物質轉運載體。研究表明I相代謝酶CYP1A1及Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽S-轉移酶、B-葡糖醛酸糖苷酶及磺基轉移酶在Caco-2細胞中也存在，并保持P-糖蛋白高表達的特征。由于其形態學及生化性質都與小腸上皮很Caco-2細胞培養于T75培養瓶中，培養液為DMEM,其中含胎牛血清、非必需氨基酸及青-鏈霉素雙抗，在37℃、5%CO?的培養箱中培養待用。當Caco-2細胞傳至20-30代時，將細胞接種在Transwell板的濾膜上，細胞接種密度為(basolateralside,BL)分別加入培養液。將細胞置于37℃,含5%CO?的培養箱(圖6所示)。2.1.3Caco-2單層細胞模型的評價AP側；(3)跨膜電阻(transepitheliumelectricalresistance,TEER)的測定，以確2.1.4Caco-2細胞模型在口服藥物吸收及機制研究方面的應用在著P-gp、MRP外排系統及細胞色素P45腔側)的轉運率，從而對主動轉運的藥物進行研究；各種轉運系統及代謝酶在某些特別的酶(細胞色素P450的一些同工酶)的活性與人體小腸上皮細胞的差馬丁達比狗腎細胞系(Madin-DarbyCanineKidney,MDCK)是Madins.H.和2.2.1MDCK細胞模型的基本特點早在1998年Rothen-RutishauserB等就發現MDCK細胞在半透膜上培養，來自同一志愿者十二指腸、空腸、回腸等細胞勻漿中P-gp的表達量，發現表1MDCK細胞與Caco-2細胞的比較項目來源人結腸腺癌狗腎上皮細胞培養周期主要轉運體肽類，核苷酸和一元羧酸一元羧酸，二肽，P-gp和陽離子肽類等優點來源于人，表達部分轉運蛋白和酶培養周期短，TEER值與人體小腸相近，試驗結果重現性較好缺點缺少黏液層，緊密連接過緊，表達的酶與小腸有差異；培養周期長表達轉運蛋白水平低，代謝活性低，來源于動物主要應用主動轉運，被動轉運被動轉運MDCK細胞培養于T75培養瓶中，培養液為含10%FBS的MEM,在37℃、5%CO?的培養箱中培養待用。約3-5d細胞融合達90%后傳代，用37℃預熱的消化液(0.25%胰酶&0.02%EDTA)室溫下消化，傳代細胞密度1.5×10?個/為了確定MDCK單層細胞的完整性，可以澄清度);(2)細胞生長曲線的繪制。觀察MDCK細胞的生長狀態，細胞計數法(3)細胞單層TEER的測定；(4)通透性的測定，通常采用熒光素鈉、甘露醇、MDCK細胞系自20世紀50年代建立開始，經過幾十年的探索，已被大多(1)腸道吸收模型。基于MDCK細胞模型的特性和優勢，該細胞模型作為從而實現對基因表達產物在藥物吸收中所起作用的研究。HeL等利用MDCK-MDR1細胞模型研究防己諾林堿對紫杉醇雙向轉運的調節作用，發現防己諾林堿能明顯減少紫杉醇的外排，并抑制P-gp介導的抗藥耐藥相關蛋白1(multidrugresistanee-associatedprotein轉運蛋白基因后，發現依托泊試的分泌轉運機制涉及P-gp和MRP2轉運蛋白，但與MRP1轉運蛋白無關。PabfaDimPle等用MDCK細胞模型研究直鏈脂肪酸對左甲狀腺素鈉(Levothyroxinesodium,T4)跨上皮轉運的影響，發現在T4合成過程中加入低濃度的直鏈脂肪酸能明顯提高T4的通透率，且不存在任何可能導致生物利用度提高的毒(2)腎臟排泄模型。體外培養的MDCK細胞之間能形成TJ、粘附連接、橋等用MDCK-MDR1模型研究了西米替丁與依曲康唑、Psc-833之間的相互作用，證實了P-gp在腎小管有機陽離子分泌中的作用。MDCK細胞轉運蛋白1亞型(UT-A1)基因轉染至MDCK細胞后，發現新構成的極化細胞模型MDCK-UT-A1穩定能表達UT-A1轉運蛋多大鼠內髓集合管上發生的生理反應。MDCK細胞來源于正常的腎組研發提供毒性預測信息。YehJH等用MDCK細胞研究了氯化汞的腎毒性及其機制，研究表明MDCK細胞對典型的腎毒物氯化汞特別選模型方法建立符合現代醫學規范的用藥方式是可以先行一步的。此外，因此是從天然產物(如中藥)中尋找具有發展前景先導化合物工作的重要方面。圖7簡示了基于中藥的ADME/T性質研究，為開發始創性候選中藥及中藥復方腸內細菌轉化小腸吸收轉化體內分布肝臟代謝/解毒/毒性膽汁排除Caco-2細胞模型藥物-血漿蛋白結合模型體外血腦屏障模型原代謝肝細胞/肝微粒體模型究熱潮(圖8所示)。從藥物研發和臨床的觀點上看，藥物轉運體的重要性在于其與藥物有效性和安全性密切相關。因為它不僅直接干預藥物的藥代動力學 0資料來源：Pubmed(統計到2014年1月)而影響藥物的治療效果(如圖9所示)。給給相關蛋白(Multidrugresistancerelatedprotein,MRP)和乳腺癌耐藥蛋白(Breastcancerresistanceprotein,BCRP)等(如表2統計),他們發揮作用均要消耗ATP,等，分子量多為50-100kDa(如表3統計)。全稱多藥耐藥基因/P-糖蛋白AU膽鹽分泌蛋白AH多藥耐藥基因/P-糖蛋白AH乳腺癌耐藥蛋白A多藥耐藥相關蛋白1U多藥耐藥相關蛋白2A多藥耐藥相關蛋白3多藥耐藥相關蛋白4AK多藥耐藥相關蛋白5U多藥耐藥相關蛋白6U表3SLC轉運體家族全稱牛膽磺酸協轉運多肽有機陰離子轉運多肽1A2有機陰離子轉運多肽1B1H有機陰離子轉運多肽1B32H有機陽離子轉運體1有機陽離子轉運體2K有機陰離子轉運體K多藥和毒化和物外排蛋白1A前列腺素轉運體U可為后續的毒性研究及臨床研究提供重要的理論依據，預測藥物可能的相互作致藥物吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADME/T)性質改變。目前報道在藥物2001年日本厚生省發布了醫藥規范第813號省令2006年FDA發布指導原則草案2010年國際轉運體聯盟(ITC)發表了白皮書2010年歐洲醫藥管理局(EMA)發布指導原則草案2012年FDA發布新的指導原則草案其中美國FDA在2006年指南中(DrugInteractionStudies-StudyDesign,Data容；2012年美國在FDA指南中又新增了UGTs和6種轉運體(BCRP,OATP1B3,OATP1B1,OCT2,OAT1,OAT3)。2010年歐洲EMA在指導原酸鹽外排泵轉運體BSEP和有機陽離子轉運體OCT1,此時藥物相互作用研究中轉運體總數達到了9種(如表4所示)。胞之間有很好的相關性，所以MDCK細胞也用作Caco-2細胞(最少21天培養),MDCK和LLC-PK1細胞具有培養周期短的優點，只需要5到6天。胞系的應用中，將MDR1基因轉染至MDCK中所建立的MDCK-MDR1細胞模單克隆資料來源：藥理學報正如上述構建方案圖中所述，經過抗性篩選的表達藥物轉運體的單克隆細胞一般從轉錄水平、蛋白表達水平和功能水平來驗證穩定高表達轉運體細胞模型(2)轉運體蛋白的表達驗證。轉運體轉錄后翻譯加工形成蛋白才可以實現外排或攝取的功能。免疫熒光染色法用于轉運蛋白定量主要是4.3MDCK-MDR1細胞株的構建及評價每孔10?種于六孔板中，培養48h。用LipofectamineTM2000pcDNA3.1-MDR1轉染進MDCK細胞內，方法參考檢測P-gp的活性(也可采用Hoechst33342外排實驗)。另外，也借助RT-PCRMDCK的總RNA,用RT-PCR檢測各細胞MDR1的mRNA表達情況。從中可Westernblotting檢測P-gp的表達：抽提各單克隆細胞和陰性對照細胞加入含4μmol/LRho123(P-gp的經典熒光底物)的D100min,吸棄上清，用冰冷的磷酸鹽緩沖液PBS洗3次，吸凈剩余的PBS,每喹啉甲酸BCA蛋白試劑盒檢測每個樣品的總蛋白量。在P-gp抑制劑對4.3.3MDCK-MDR1細胞株建立的意義及應用相關的方面，還可以進行其他載體轉運藥物的研究。Luo等研究發現，在MDCK-MDR1細胞中存在Na+-依賴性維生素C轉運載體(SVCT),說明轉運子如多藥耐藥相關蛋白MRP、乳腺癌耐藥蛋白BCRP等，早在20世紀90年代初，Caco-2細胞胞轉運子表達水平影響很大是Caco-2細胞兩個突出的缺點，而中的作用，及高表達P-gp的MDCK-MDR1細胞系是一種很理想的評與I型星形膠質細胞(typeIastrocytes,TIA)體外共培養易丟失部分甚細胞是作為BBB藥物透過快速篩選的理想模型。Madgula等以和前胡醇當歸酯(decursinolangelate)透過BBB的中樞神經系統(cen作用組胺拮抗劑(西替立嗪、氯雷他定)是P-gp的底物，限制了大腦4.4LLC-PK1-BCRP細胞株的構建及其評價篩選了BCRP蛋白的底物和抑制劑以及研究BCRP基因的多態性。4.4.2LLC-PK1-BCRP細胞株的生物學特征及功能性檢測Hoechst33342的外排作用，并以GF120918為BCRP抑制劑觀察其對BCRP外瞬轉pcDNA3.1-BCRP質粒的LLC-PK1細胞)。圖中A和C為用Hoechst33342 了很多倍(流式細胞儀分選)。4.4.3