第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W習目標1.概述基因工程的基本操作程序。2.說明利用PCR技術(shù)擴增目的基因的基本過程。3.理解基因表達載體的結(jié)構(gòu)和各部分的作用及基因表達載體的構(gòu)建。4.舉例說明獲取目的基因的途徑,目的基因?qū)胧荏w細胞的方法、檢測與鑒定目的基因的方法。一、基因工程的基本操作程序1.目的基因的篩選與獲取。2.基因表達載體的構(gòu)建。3.將目的基因?qū)胧荏w細胞。4.目的基因的檢測與鑒定。二、目的基因的篩選與獲取1.目的基因:用于改變受體細胞性狀或獲得預期表達產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因,如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生物制藥、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。2.篩選合適的目的基因(1)從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進行篩選。(2)應(yīng)用測序技術(shù)、序列數(shù)據(jù)庫、序列比對工具等認知更多的基因結(jié)構(gòu)和功能,以便找到合適的目的基因。3.獲取目的基因的途徑(1)人工合成目的基因;(2)構(gòu)建基因文庫獲取目的基因;(3)PCR獲取目的基因。4.利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的目的:在體外對目的基因的核酸序列進行大量復制。(2)PCR原理:DNA半保留復制。(3)PCR條件:一定的緩沖溶液、DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。(4)每次循環(huán)的過程:變性→復性→延伸。①變性:加熱至90℃以上時,雙鏈DNA解聚為單鏈。②復性:冷卻至50

℃左右時,兩種引物通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。③延伸:加熱至72℃左右時,4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下,根據(jù)堿基互補配對原則合成新的DNA鏈。(5)特點:上一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為下一輪反應(yīng)的模板,每一次循環(huán)后,目的基因的量可以增加一倍,即成指數(shù)形式擴增(約為2n,n為擴增循環(huán)的次數(shù))。(6)鑒定:常用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物。①DNA分子具有可解離的基團,在一定的pH下,這些基團可以帶上正電荷或負電荷。在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動,這個過程就是電泳。②在瓊脂糖凝膠電泳時,DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。③凝膠中的DNA分子通過染色,可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。預習反饋1.判斷正誤。(1)PCR反應(yīng)中溫度的周期性改變是為了DNA聚合酶催化不同的反應(yīng)。(×)(2)用PCR方法擴增目的基因時不必知道基因的全部序列。(

√)(3)PCR體系中一定要添加從受體細胞中提取的DNA聚合酶。(×)2.下列有關(guān)PCR技術(shù)的說法,錯誤的是(

)A.PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)B.PCR技術(shù)的原理是DNA半保留復制C.利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列D.PCR擴增中需要解旋酶解開雙鏈DNA答案D解析PCR是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù),其原理是DNA半保留復制,A項和B項正確;利用PCR技術(shù)獲取目的基因的前提是要有一段已知的目的基因的核苷酸序列,以便根據(jù)這一序列合成引物,C項正確;PCR擴增中雙鏈DNA受熱變性后解聚為單鏈,不需要解旋酶解開雙鏈DNA,D項錯誤。三、基因表達載體的構(gòu)建1.基因表達載體構(gòu)建的目的使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代,同時,使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。2.基因表達載體的組成

3.基因表達載體的構(gòu)建過程一般用同種或能產(chǎn)生相同末端的限制酶分別切割載體和目的基因,再用DNA連接酶把兩者連接,形成一個重組DNA分子(如下圖)。預習反饋1.判斷正誤。(1)表達載體的復制和目的基因的表達均啟動于復制原點。(×)(2)外源DNA必須位于重組質(zhì)粒的啟動子上游或終止子的下游才能進行表達。(×)(3)

基因表達載體中需要含有起始密碼、終止密碼、目的基因、標記基因。(×)(4)借助抗生素抗性基因可將含目的基因的受體細胞篩選出來。(√)2.下列有關(guān)人胰島素基因表達載體的敘述,正確的是(

)A.表達載體中的胰島素基因可通過人肝細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得B.表達載體的復制開始于啟動子C.胰島素基因必須插入啟動子與終止子之間D.啟動子和終止密碼子均在胰島素基因的轉(zhuǎn)錄中起作用答案C解析由于人肝細胞中胰島素基因不能表達,所以無法利用肝細胞中的mRNA反轉(zhuǎn)錄獲得胰島素基因,A項錯誤;表達載體的復制啟動于復制原點,B項錯誤;胰島素基因必須插入啟動子與終止子之間,C項正確;啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,是轉(zhuǎn)錄的起點,而終止密碼子位于mRNA上,在翻譯中起作用,D項錯誤。四、將目的基因?qū)胧荏w細胞1.導入植物細胞(1)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。利用農(nóng)桿菌細胞中Ti質(zhì)粒上的T-DNA(可轉(zhuǎn)移DNA)能夠轉(zhuǎn)移并整合到侵染細胞的染色體DNA上的特點,將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA中,通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用,可以使目的基因進入植物細胞。(2)花粉管通道法。①用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入子房中。②在植物受粉后的一段時間內(nèi),剪去柱頭,將DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道進入囊胚。2.導入動物細胞(受精卵)顯微注射技術(shù)。3.導入微生物細胞用Ca2+處理細胞,使受體細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),再將重組的基因表達載體導入其中。預習反饋1.判斷正誤。(1)目的基因?qū)胫参锛毎话悴捎棉r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(√)(2)為培育抗除草劑的作物新品種,導入抗除草劑基因時只能以受精卵為受體。(×)(3)常用卵細胞作為培育轉(zhuǎn)基因動物的受體細胞。(×)2.(多選)下圖為科學家通過基因工程培育抗蟲棉時,從蘇云金芽孢桿菌中提取抗蟲基因“放入”棉花細胞中與棉花的DNA分子“結(jié)合起來”而發(fā)揮作用的過程示意圖。以下相關(guān)說法正確的是(

)A.圖中Ⅰ是質(zhì)粒,步驟①需要用到限制酶和DNA聚合酶B.圖中Ⅱ是含目的基因的重組質(zhì)粒,步驟②是將重組質(zhì)粒導入棉花細胞C.圖中Ⅲ是農(nóng)桿菌,通過步驟③將目的基因?qū)胫参锛毎鸇.剔除培育成功的抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不會影響抗蟲基因的表達答案CD解析Ⅰ為質(zhì)粒,步驟①為基因表達載體的構(gòu)建,需要用到限制酶和DNA連接酶,A項錯誤;圖中步驟②是將重組質(zhì)粒導入農(nóng)桿菌細胞,B項錯誤;圖中步驟③是將目的基因?qū)胫参锛毎?C項正確;基因的表達具有一定的獨立性,剔除抗蟲棉體內(nèi)的四環(huán)素抗性基因不影響抗蟲基因的表達,D項正確。五、目的基因的檢測與鑒定1.分子水平的檢測(1)檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中。(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。(3)檢測目的基因是否翻譯出相應(yīng)蛋白質(zhì),通常用抗體進行抗原—抗體雜交。2.個體生物學水平的鑒定(1)通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。(2)通過相應(yīng)病原微生物感染生物來確定相應(yīng)抗病基因是否賦予了受體生物抗病特性以及抗性的程度。預習反饋1.判斷正誤。(1)轉(zhuǎn)基因抗蟲棉植株抗蟲效果的鑒定必須通過分子檢測。(×)(2)抗蟲基因即使成功地插入植物細胞染色體上也未必能正常表達。(√)(3)檢測目的基因是否插入受體細胞的DNA中,可用抗原—抗體雜交技術(shù)。(×)2.下列判斷抗蟲基因是否成功轉(zhuǎn)入棉花基因組的方法中,不屬于分子檢測的是(

)A.通過觀察害蟲吃棉葉是否死亡B.檢測棉花基因組DNA與DNA探針能否形成雜交帶C.檢測棉花細胞中mRNA與DNA探針能否形成雜交帶D.檢測棉花細胞中的蛋白質(zhì)能否與特定抗體形成雜交帶答案A解析A項屬于個體水平的鑒定,不是分子檢測。探究點一探究點二探究點三探究點四目的基因的篩選與獲取情境導引巴西等拉美國家深受致倦庫蚊的危害。致倦庫蚊可攜帶多種病毒和寄生蟲,能夠傳播腦炎、絲蟲等傳染病,而這些傳染病常年在拉美國家肆虐。為了抑制疾病的傳播,科學家培育出了一種轉(zhuǎn)基因雄性致倦庫蚊。科學家在雄性致倦庫蚊體內(nèi)植入一種特殊基因,當具有該基因的雄蚊與野生雌蚊交配時,這種基因可以進入雌蚊的基因組,并使雌蚊死亡,從而達到減少該種蚊子的數(shù)量,抑制疾病傳播的目的。探究點一探究點二探究點三探究點四請討論回答下列問題。1.該項研究的目的基因是什么?其作用是什么?提示植入雄性致倦庫蚊體內(nèi)的一種特殊基因是該項研究的目的基因。該基因可以進入雌蚊的基因組,并使雌蚊死亡,從而減少該種蚊子的數(shù)量,抑制疾病傳播。探究點一探究點二探究點三探究點四2.根據(jù)PCR獲取和擴增目的基因的反應(yīng)條件,完善表格。

條

件作

用在一定的緩沖液中進行提供相對穩(wěn)定的

環(huán)境

合成DNA子鏈的原料DNA母鏈

催化合成DNA子鏈

與DNA母鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合答案pH

4種脫氧核苷酸提供DNA復制的模板耐高溫的DNA聚合酶引物探究點一探究點二探究點三探究點四3.PCR反應(yīng)的過程

答案變性解旋復性堿基互補配對延伸5'端向3'端延伸

探究點一探究點二探究點三探究點四歸納提升1.PCR技術(shù)與細胞內(nèi)DNA復制的比較比較項目細胞內(nèi)DNA復制PCR技術(shù)區(qū)別解旋方式解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋場所主要在細胞核內(nèi)PCR擴增儀(PCR儀)酶解旋酶、DNA聚合酶耐高溫的DNA聚合酶溫度細胞內(nèi)溫和條件控制溫度,在不同溫度下進行結(jié)果合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因聯(lián)系(1)模板:均需要脫氧核苷酸單鏈作為模板(2)原料:均為4種脫氧核苷酸(3)酶:均需DNA聚合酶(4)引物:都需要引物,使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成探究點一探究點二探究點三探究點四2.PCR反應(yīng)中應(yīng)注意的問題(1)PCR設(shè)計的引物序列長度一般介于20~30個核苷酸,若引物序列太長會使擴增效率降低,而引物太短又容易導致異常DNA的產(chǎn)生。(2)PCR技術(shù)通過高溫加熱使雙鏈DNA解旋,該過程不需要解旋酶的參與。雙鏈DNA在高溫下解鏈的現(xiàn)象稱為DNA的變性,在降溫時,雙鏈可以重新形成,所以DNA的熱變性是可逆的。(3)PCR擴增時,復性溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。復性溫度的設(shè)定主要與引物的長度和堿基組成中G—C比例呈正相關(guān)。如果復性溫度太高,引物無法與模版鏈結(jié)合,無法進行DNA復制,PCR反應(yīng)得不到任何擴增產(chǎn)物。(4)DNA聚合酶從引物的3'端開始拼接單個的脫氧核苷酸進行PCR擴增。探究點一探究點二探究點三探究點四3.目的基因獲取方法的選擇(1)PCR擴增。必須有目的基因上一段已知序列,以便設(shè)計引物。(2)人工合成。目的基因片段小,序列已知。(3)基因文庫中獲取。目的基因序列未知。探究點一探究點二探究點三探究點四典例剖析(多選)以下為逆轉(zhuǎn)錄過程和PCR擴增過程示意圖。據(jù)圖分析,下列說法正確的是(

)A.催化①過程的酶是逆轉(zhuǎn)錄酶B.④過程發(fā)生的變化是引物與單鏈DNA結(jié)合C.催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶D.如果RNA單鏈中A與U之和占該鏈堿基含量的40%,則一個雙鏈DNA中,A與U之和也占該DNA堿基含量的40%探究點一探究點二探究點三探究點四答案ABC解析由題意可知,①②③④⑤分別表示的過程是逆轉(zhuǎn)錄、DNA的復制、DNA解鏈、引物結(jié)合到互補DNA鏈、DNA子鏈的合成,B項正確;①過程由逆轉(zhuǎn)錄酶催化完成,A項正確;催化②⑤過程的酶都是DNA聚合酶,C項正確;在DNA分子中有T無U,D項錯誤。探究點一探究點二探究點三探究點四活學活練1.下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述,錯誤的是(

)A.PCR即聚合酶鏈式反應(yīng),利用其可獲取大量目的基因B.PCR的原理是DNA半保留復制,可以在儀器中自動完成C.PCR技術(shù)擴增目的基因時要知道目的基因的部分序列D.PCR技術(shù)擴增目的基因時必須用解旋酶解開雙鏈DNA答案D解析PCR

即聚合酶鏈式反應(yīng),利用其可獲取大量目的基因,A項正確;PCR

的原理是

DNA

半保留復制,可以在儀器(PCR儀)中自動完成,B項正確;PCR

技術(shù)擴增目的基因時要知道目的基因的部分序列,以便設(shè)計引物,C項正確;PCR

技術(shù)擴增目的基因時用高溫解開雙鏈

DNA,D項錯誤。探究點一探究點二探究點三探究點四2.PCR技術(shù)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,利用該方法可以使目的基因迅速擴增,其簡要過程如圖所示。下列關(guān)于PCR技術(shù)的敘述,錯誤的是(

)A.PCR和體內(nèi)DNA復制都需要模板、能量B.由PCR的反應(yīng)過程可知,與氫鍵相比,磷酸二酯鍵對高溫的穩(wěn)定性更強C.PCR和體內(nèi)DNA復制都要消耗4種脫氧核苷酸和2種引物D.PCR反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板探究點一探究點二探究點三探究點四答案C解析PCR技術(shù)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù),以極少量DNA為模板,復制出大量DNA,與體內(nèi)DNA復制一樣,都需要模板和能量,A項正確;由PCR的反應(yīng)過程可知,高溫使雙鏈DNA解鏈,破壞的是堿基間的氫鍵,而沒有破壞磷酸二酯鍵,則磷酸二酯鍵對高溫的穩(wěn)定性更強,B項正確;PCR和體內(nèi)DNA復制都要消耗4種脫氧核苷酸,PCR是先解旋后復制特定DNA序列,需2種引物,而細胞內(nèi)DNA復制是邊解旋邊復制,則需多種引物,C項錯誤;PCR反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板,繼續(xù)合成子代DNA片段,D項正確。探究點一探究點二探究點三探究點四基因表達載體的構(gòu)建情境導引游離的DNA進入細胞內(nèi),一般會直接被分解,就算可以進行轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì),游離DNA也無法跟著細胞分裂進行復制,導致子代細胞中不再含有該游離DNA。若游離的DNA整合至細胞的染色體DNA上,或以一種形式在細胞內(nèi)獨立穩(wěn)定存在,能自我復制,則該游離DNA上的基因會隨細胞分裂傳遞給子細胞或子代。請討論回答下列問題。1.通過PCR技術(shù)獲取足夠量的目的基因后,能夠直接導入受體細胞嗎?為什么?提示不能。若將目的基因直接導入受體細胞,目的基因可能被受體細胞分解或無法隨細胞分裂進行復制,不能穩(wěn)定遺傳和表達。探究點一探究點二探究點三探究點四2.基因表達載體的基本組成有哪幾部分?提示目的基因、啟動子、終止子、標記基因等。3.標記基因的作用是什么?常用什么基因來作標記基因?提示標記基因的作用是為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因,從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用抗性基因作為標記基因。4.培育轉(zhuǎn)基因生物的核心工作是什么?構(gòu)建基因表達載體的目的是什么?提示培育轉(zhuǎn)基因生物的核心工作是基因表達載體的構(gòu)建。構(gòu)建基因表達載體的目的:(1)使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在,并且可以遺傳給下一代;(2)使目的基因能夠在受體細胞中表達和發(fā)揮作用。探究點一探究點二探究點三探究點四歸納提升1.構(gòu)建基因表達載體時限制酶的選擇技巧探究點一探究點二探究點三探究點四根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類①應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶,如圖甲可選擇PstⅠ;②不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如圖甲不能選擇SmaⅠ;③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如圖甲也可選擇用Pst

Ⅰ和EcoRⅠ兩種限制酶(但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致,以確保產(chǎn)生相同的黏性末端;②質(zhì)粒作為載體必須具備標記基因等,所以所選擇的限制酶盡量不要破壞這些結(jié)構(gòu),如圖乙中限制酶SmaⅠ會破壞標記基因;③如果所選酶的切割位點不止一個,則切割重組后可能丟失某些片段,若丟失的片段含復制起點區(qū),則切割重組后的片段進入受體細胞后不能進行復制探究點一探究點二探究點三探究點四2.啟動子、終止子與起始密碼子、終止密碼子的區(qū)別

項目啟動子終止子起始密碼子終止密碼子本質(zhì)有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段mRNA上三個相鄰堿基mRNA上三個相鄰堿基位置基因上游基因下游mRNA首端mRNA尾端作用RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位,驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄終止轉(zhuǎn)錄翻譯的起始點終止翻譯探究點一探究點二探究點三探究點四易錯提醒

基因表達載體易錯點剖析(1)基因工程中的基因表達載體不等同于載體。基因表達載體與載體相比增加了目的基因。(2)目的基因插入位點不是隨意的。目的基因應(yīng)插入啟動子和終止子之間的部位,若目的基因插入啟動子部位,目的基因?qū)o法表達。探究點一探究點二探究點三探究點四典例剖析如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物,進而生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯誤的是(

)探究點一探究點二探究點三探究點四A.圖示過程是基因工程的核心步驟B.表達載體構(gòu)建時需要用到限制酶SmaⅠC.抗卡那霉素基因的存在有利于將含有抗原基因的細胞篩選出來D.除圖示組成外,表達載體中還應(yīng)該含有啟動子和終止子等結(jié)構(gòu)答案B解析圖示過程為基因表達載體的構(gòu)建過程,是基因工程中的核心步驟,A項正確;構(gòu)建表達載體過程中需要將目的基因完整切割下來,此時要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ,B項錯誤;抗卡那霉素基因是標記基因,目的是便于鑒定和篩選含有目的基因的細胞,C項正確;基因表達載體應(yīng)包括啟動子、目的基因、終止子和標記基因等結(jié)構(gòu),D項正確。探究點一探究點二探究點三探究點四活學活練1.下列有關(guān)抗蟲基因表達載體的敘述,正確的是(

)A.切割含抗蟲基因的DNA片段和載體必須用同一種限制酶B.抗蟲基因表達載體中要有啟動子和終止密碼子C.抗蟲基因表達載體必須具備標記基因,其作用是篩選含有目的基因的受體細胞D.抗蟲基因的表達啟動于復制原點探究點一探究點二探究點三探究點四答案C解析切割含抗蟲基因的DNA片段和載體可以用不同的限制酶,只要切割出的切口末端相同即可,A項錯誤;抗蟲基因表達載體必須具備啟動子和終止子,終止密碼子位于mRNA上,B項錯誤;基因表達載體必須具備標記基因,其作用是用于檢測目的基因是否導入到受體細胞中,從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來,C項正確;抗蟲基因的表達開始于啟動子,D項錯誤。探究點一探究點二探究點三探究點四2.圖甲、乙中的箭頭表示限制性內(nèi)切核酸酶的酶切位點,ampr表示氨芐青霉素抗性基因,neo表示新霉素抗性基因。下列敘述正確的是(

)A.圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后,含有4個游離的磷酸基團B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,可用Pst

Ⅰ和BamHⅠ切割質(zhì)粒和外源DNAC.用Pst

Ⅰ和HindⅢ切割質(zhì)粒和外源DNA,可以保證重組DNA序列的唯一性D.導入目的基因的大腸桿菌可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長探究點一探究點二探究點三探究點四答案C解析圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后,獲得一個DNA片段,其只含有2個游離的磷酸基團,A項錯誤;在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,不能使用BamHⅠ切割外源DNA,因為用BamHⅠ會破壞目的基因的結(jié)構(gòu),但可以用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割質(zhì)粒和外源DNA,B項錯誤;用PstⅠ和Hind

Ⅲ切割質(zhì)粒,切開的質(zhì)粒由于兩切口處黏性末端不同,不會自身連接,用這兩種限制酶切割外源DNA,可得到目的基因的完整序列,且切口處黏性末端只能與切開的質(zhì)粒的互補的黏性末端連接,保證了重組DNA序列的唯一性,C項正確;由于用PstⅠ切割質(zhì)粒后,其中的氨芐青霉素抗性基因已被破壞,所以導入目的基因的大腸桿菌不能在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長,D項錯誤。探究點一探究點二探究點三探究點四將目的基因?qū)胧荏w細胞情境導引下圖表示培育轉(zhuǎn)基因抗病毒番茄的過程示意圖。探究點一探究點二探究點三探究點四請回答下列問題。1.簡述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胫参锛毎倪^程。提示將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA中,通過農(nóng)桿菌對植物細胞的侵染作用,Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移至被侵染的植物細胞,并將其整合到該細胞的染色體DNA上。2.將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫氖悄姆N方法?簡便經(jīng)濟的方法是哪種?我國科學家獨創(chuàng)的方法是哪種?提示農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法最常用。除此之外還有花粉管通道法,這是一種更為簡便經(jīng)濟的方法,也是我國科學家獨創(chuàng)的方法。探究點一探究點二探究點三探究點四3.將目的基因?qū)雱游锛毎ǔ２捎玫姆椒ㄊ鞘裁?選取的受體細胞是什么細胞?提示顯微注射法。受精卵。4.簡述將目的基因?qū)氪竽c桿菌的基本過程。提示用Ca2+處理大腸桿菌細胞,使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),這種細胞稱為感受態(tài)細胞。基因表達載體溶于緩沖液中與感受態(tài)細胞混合,在一定的溫度下促進感受態(tài)細胞吸收基因表達載體。探究點一探究點二探究點三探究點四歸納提升1.受體細胞的選擇(1)對于植物來說,受體細胞可以是受精卵或體細胞,因為植物細胞具有全能性。(2)對于動物來說,受體細胞一般是受精卵,因為受精卵的全能性高,而高度分化的動物體細胞的全能性受到抑制。(3)大腸桿菌和酵母菌在基因工程中都可以作為受體細胞,但又有所不同。大腸桿菌為原核細胞,而酵母菌為真核細胞(具有多種細胞器),所以在生產(chǎn)需要加工和分泌的蛋白質(zhì)時,酵母菌比大腸桿菌有優(yōu)勢。探究點一探究點二探究點三探究點四2.目的基因在受體細胞中的位置不同會引起遺傳上的差別

探究點一探究點二探究點三探究點四(1)圖中a細胞減數(shù)分裂時,細胞質(zhì)是不均分的,子細胞不一定含有目的基因。(2)圖中b在進行細胞減數(shù)分裂時,細胞核中的DNA經(jīng)復制后平均分配到兩個子細胞中,保證了親子代遺傳性狀的穩(wěn)定性,細胞中目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。易錯提醒

在將目的基因?qū)胧荏w細胞之前,都必須進行基因表達載體的構(gòu)建,也就是說導入受體細胞的必須是重組DNA分子,而不是直接導入目的基因。探究點一探究點二探究點三探究點四典例剖析(多選)下圖表示培育轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物的過程示意圖。下列敘述正確的是(

)A.過程a需要限制酶和DNA連接酶的參與B.過程b需要用CaCl2處理,以提高農(nóng)作物細胞細胞壁的通透性C.抗病毒基因一旦整合到農(nóng)作物細胞的染色體上,就能正常表達D.轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物是否培育成功可通過接種特定病毒進行鑒定探究點一探究點二探究點三探究點四答案AD解析題圖中過程a為構(gòu)建基因表達載體,需要用到限制酶和DNA連接酶,A項正確;CaCl2處理只是提高農(nóng)桿菌細胞(原核細胞)細胞壁的通透性,B項錯誤;抗植物病毒基因整合到農(nóng)作物細胞的染色體上,不一定能表達,C項錯誤;轉(zhuǎn)基因抗病毒農(nóng)作物是否培育成功可通過接種特定病毒,觀察農(nóng)作物是否被感染來進行鑒定,D項正確。探究點一探究點二探究點三探究點四活學活練受體細胞不同,將目的基因?qū)胧荏w細胞的方法也不相同,下列受體細胞與導入方法匹配錯誤的是(

)選項受體細胞導入方法A棉花細胞花粉管通道法B大腸桿菌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法C羊受精卵顯微注射法D水稻細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法探究點一探究點二探究點三探究點四答案B解析花粉管通道法是一種十分簡便、經(jīng)濟的方法,我國的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育過程用到此種方法,A項正確;將目的基因?qū)胛⑸锛毎肅a2+處理法,這種方法能使大腸桿菌細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài),B項錯誤;顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱游锛毎?如羊受精卵)的最常用、最有效的方法,C項正確;可用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胨炯毎?D項正確。探究點一探究點二探究點三探究點四目的基因的檢測與鑒定下圖為抗蟲棉的接種實驗,結(jié)合圖示(左圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉使蟲體發(fā)育不正常)探究以下問題。1.分子水平的鑒定包括哪些內(nèi)容?提示目的基因的檢測與鑒定在分子水平包括:目的基因是否插入受體DNA,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA和目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)三個層次。探究點一探究點二探究點三探究點四2.觀察下圖,完善目的基因是否導入受體細胞,目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA的鑒定方法和原理。探究點一探究點二探究點三探究點四(1)由圖可知,

的基本原理是具有一定同源性的兩條DNA單鏈,在一定條件下(適宜的溫度等)按照

原則形成雙鏈。雜交過程是高度特異性的,雜交的雙方是

和用放射性同位素標記的

(又稱基因探針)。若轉(zhuǎn)基因生物的染色體DNA中有能與探針

的特異DNA片段,用于示蹤的放射性同位素標記將指示其所在的位置,表明目的基因已插入到轉(zhuǎn)基因生物

中。

(2)同理,利用DNA和mRNA之間分子雜交技術(shù),檢測目的基因是否

。

答案(1)DNA分子雜交法堿基互補配對待測的DNA已知DNA片段互補染色體的DNA

(2)轉(zhuǎn)錄出mRNA探究點一探究點二探究點三探究點四3.如何檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)?提示提取轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì),以相應(yīng)的抗體進行抗原—抗體雜交,若出現(xiàn)雜交帶說明目的基因表達出相應(yīng)蛋白質(zhì)。也可進行個體生物學水平的鑒定。4.對于轉(zhuǎn)基因抗蟲或抗病植株,在個體生物學水平的鑒定包括哪些內(nèi)容?提示一個抗蟲或抗病的目的基因?qū)胫参锛毎?是否賦予了植物抗蟲或抗病特性,在個體生物學水平上需要做抗蟲或抗病的接種實驗,以確定是否具有抗性以及抗性的程度。探究點一探究點二探究點三探究點四歸納提升1.目的基因的檢測與鑒定探究點一探究點二探究點三探究點四2.不同分子檢測原理的異同(1)檢測目的基因是否插入受體DNA中、目的基因是否轉(zhuǎn)錄時,用的探針都是放射性同位素等標記的含有目的基因的DNA片段。檢測原理都是堿基互補配對原則,只是被檢測的物質(zhì)不同,一個是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA,一個是轉(zhuǎn)基因生物細胞內(nèi)的mRNA。(2)進行翻譯水平的檢測,通常以目的基因表達產(chǎn)物(蛋白質(zhì))作抗原,制備相應(yīng)抗體,檢測轉(zhuǎn)基因生物的蛋白質(zhì),利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理。(3)不論是復制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平的檢測,都是在體外進行的。探究點一探究點二探究點三探究點四易錯提醒

基因工程操作過程中堿基互補配對現(xiàn)象基因工程操作過程中只有第三步“將目的基因?qū)胧荏w細胞”沒有堿基互補配對現(xiàn)象;第一步篩選與獲取目的基因,用人工合成、PCR獲取或基因文庫獲取,三種常用方法都涉及堿基