6.生物技術與工程(分值:69分)學生用書P257

1.(2024·內蒙古包頭三模)(13分)海洋石油污染正引起廣泛關注,利用基因工程菌進行生物降解具有巨大的應用潛力。P450是石油降解的關鍵酶,科研人員將獲得的P450基因與質粒重組,構建基因表達載體,導入土著菌種Y9,獲得了基因工程菌P450/Y9。回答下列問題。(1)實驗室培養微生物離不開培養基,而培養基中主要的四大類營養物質是,常用的接種方法有(答出兩種即可)。

(2)微生物培養最基本的要求是無菌操作,下列對培養基、接種環、雙手、牛奶所采用的滅菌消毒方法的正確順序依次是(填序號:①化學消毒、②高壓蒸汽滅菌、③灼燒滅菌、④巴氏消毒法)。

(3)為進一步探究并比較P450/Y9和Y9兩個菌株在不同條件下降解石油的能力,研究人員選用兩種培養基(成分如下表)進行了如下實驗:培養基類型成分培養基ⅠK2HPO4、MgSO4、NH4NO3、石油培養基ⅡK2HPO4、MgSO4、石油步驟一,將P450/Y9、Y9兩個菌株分別接種在兩液體培養基Ⅰ中,得到P450/Y9、Y9菌液。步驟二,另取培養基Ⅰ、Ⅱ,添加瓊脂分別制成平板Ⅰ、Ⅱ。在平板Ⅰ上制作兩個直徑相等的孔,標號ⅠA、ⅠB,平板Ⅱ也進行同樣的操作,兩個孔分別標號ⅡA、ⅡB。步驟三,將等量等濃度的P450/Y9菌液、Y9菌液分別接種到平板Ⅰ的ⅠA、ⅠB,平板Ⅱ也進行同樣的操作。步驟四,相同且適宜條件下培養一段時間,記錄平板Ⅰ、Ⅱ的透明圈大小如下表:平板平板Ⅰ平板Ⅱ菌株ⅠAⅠBⅡAⅡB透明圈大小+++++++注:“+”表示有透明圈,“+”越多表示透明圈越大,“”表示無透明圈。①培養基Ⅰ和培養基Ⅱ中提供碳源的都是。

②本實驗的自變量是,平板上出現透明圈的原因是。

③本實驗可以得出的結論是

。

答案(1)碳源、氮源、無機鹽和水平板劃線法和稀釋涂布平板法(2)②③①④(3)①石油②培養基的成分和菌株的類型細菌將平板中的石油分解③在有氮源的培養基上,P450/Y9菌株降解石油的能力高于Y9菌株;在無氮源的培養基上,Y9菌株無降解石油的能力,P450/Y9菌株降解石油的能力減弱解析(1)培養基中主要的四大類營養物質是碳源、氮源、無機鹽和水,常用的接種方法有平板劃線法和稀釋涂布平板法。(2)培養基要進行②高壓蒸汽滅菌;接種環進行③灼燒滅菌;雙手進行①化學消毒;牛奶采用④巴氏消毒法進行消毒。(3)實驗目的為探究并比較P450/Y9和Y9兩個菌株在不同條件下降解石油的能力。①培養基Ⅰ和培養基Ⅱ中提供碳源的都是石油。②本實驗中人為改變的變量是培養基的成分和菌株的類型,所以培養基的成分和菌株的類型是本實驗的自變量。由于細菌將平板中的石油分解,則在平板上出現透明圈。③培養基Ⅰ和培養基Ⅱ的區別就是培養基Ⅰ有氮源,培養基Ⅱ沒有氮源,所以根據本實驗中透明圈的大小可以判斷在有氮源的培養基上,P450/Y9菌株降解石油的能力高于Y9菌株;在無氮源的培養基上,Y9菌株無降解石油的能力,但P450/Y9菌株降解石油的能力減弱。2.(2024·廣東廣州二模)(10分)癌癥的免疫療法通過重新激活抗腫瘤的免疫細胞,克服腫瘤的免疫逃逸,科研人員在不斷研究中發現多種免疫治療方法的結合是提高治療效果的途徑之一。請回答下列問題。圖1圖2(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞,這體現了免疫系統的功能。

(2)由于基因突變,癌細胞表面物質發生改變,如某些種類癌細胞表面高表達膜蛋白PSMA和PDL1。圖1中PDL1能抑制T細胞的活化,使癌細胞發生免疫逃逸。臨床上可利用PD1的單克隆抗體進行癌癥治療,據圖1推測,其原因是

。

(3)CD28是T細胞表面受體,T細胞的有效激活依賴于CD28在癌細胞與T細胞結合部位的聚集。因此,科研人員嘗試構建既能結合PSMA又能結合CD28的雙特異性抗體PSMA×CD28,誘導T細胞定向殺傷癌細胞,如圖2所示。制備過程:先將分別注射到小鼠體內,分離出B淋巴細胞,誘導其與小鼠的骨髓瘤細胞融合,篩選得到,再誘導兩種細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈,由于會產生多種抗體,因此還需進行篩選,才能獲得所需的雙特異性抗體PSMA×CD28。

(4)科研人員將癌細胞和T細胞共同培養,加入不同抗體,比較不同抗體對T細胞活化的作用。實驗各組由活化T細胞產生的細胞因子IL2含量如圖3所示,實驗結果說明

。

圖3答案(1)免疫監視(2)PD1的單克隆抗體與PD1結合,阻斷了PD1和PDL1的結合,避免PDL1抑制T細胞的活化(3)PSMA、CD28兩種雜交瘤細胞L鏈和H鏈隨機組合(4)PSMA×CD28和PD1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞,且在一定范圍內激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強;單獨使用PSMA×CD28或PD1單抗都不能顯著激活T細胞(合理即可)解析(1)免疫系統能夠識別和清除突變的細胞,這體現了免疫系統的免疫監視功能。(2)圖1中癌細胞表面的PDL1和T細胞表面的PD1結合,抑制T細胞的活化。PD1的單克隆抗體與PD1特異性結合,阻斷了PDL1和PD1的結合,避免PDL1抑制T細胞的活化。(3)制備雙特異性抗體PSMA×CD28,則抗原是CD28和PSMA,將兩種物質分別注射到小鼠體內,分離出兩類B淋巴細胞,將這兩類B淋巴細胞分別和小鼠的骨髓瘤細胞融合,形成雜交瘤細胞,再誘導雜交瘤細胞融合。成功融合的細胞會表達兩種L鏈和兩種H鏈,所需的雙特異性抗體PSMA×CD28是特定的L鏈和H鏈結合形成的,由于L鏈和H鏈隨機組合,因此還需要進行篩選,才能獲得所需的抗體。(4)分析圖3可知,自變量是抗體種類,PSMA×CD28+PD1單抗聯合使用能夠顯著激活T細胞,且在一定范圍內激活作用隨PSMA×CD28濃度的增加而增強;單獨使用PSMA×CD28或PD1單抗都不能顯著激活T細胞。3.(2024·江西二模)(14分)熒光蛋白GFP在紫外線或藍光激發下會發出綠色熒光,這一特性可以用于檢測細胞中目的基因的表達。科研團隊將人β酪蛋白基因與GFP基因連接,獲得了β酪蛋白—GFP融合基因(簡稱甲),將其插入質粒P0,構建了基因表達載體P1,其部分結構如圖所示,圖中E1、E2為兩種限制酶酶切位點。回答下列問題。(1)構建融合基因甲時需要將β酪蛋白基因編碼鏈(轉錄時與模板鏈互補的DNA單鏈)的端與GFP基因編碼鏈的端相連。為保證甲的完整性及其與質粒PO正確連接,實驗中選擇的限制酶E1和E2必須滿足的條件是(答兩點)。基因表達載體P1除了具有圖示結構外,還應具備的結構有。

(2)若編碼β酪蛋白的DNA片段序列是:5'TTCGCTTCT……CAGGAAGGA3',擴增該基因時,在PCR儀中加入的引物的堿基序列為

。

(3)科研團隊將P1轉入山羊乳腺細胞后,在該細胞中觀察到了綠色熒光。為獲得能生產β酪蛋白的山羊,還應該完成的主要工作包括:將能夠產生綠色熒光的移入中,體外培養至時期,再進行胚胎移植等。其中,進行體外胚胎培養時所需的氣體環境是。

(4)檢查生產人β酪蛋白的轉基因山羊是否培育成功,還需要進行分子水平的檢測,利用PCR技術可以檢測

(答兩點)。

答案(1)3'5'甲內部沒有E1、E2的識別序列;E1、E2酶切后形成的黏性末端不同復制原點和標記基因(2)5'TTCGCTTCT3'、5'TCCTTCCTG3'(3)乳腺細胞細胞核MⅡ中去核卵母細胞桑葚胚或囊胚95%的空氣和5%的CO2形成的混合氣體(4)山羊的染色體DNA上是否插入了甲;甲是否轉錄出了相應的mRNA解析(1)構建融合基因甲時需要將β酪蛋白基因編碼鏈的3'端與GFP基因編碼鏈的5'端相連,以保證融合基因甲的核苷酸序列不發生改變,從而保證融合基因能夠正確表達。為保證甲的完整性,在基因甲中應沒有E1、E2的識別序列,同時要使基因甲與質粒PO正確連接,應該確保E1、E2酶切后形成的黏性末端不同,這樣可以防止基因甲及質粒PO的自身環化和反向連接。完整基因表達載體應具有啟動子、終止子、復制原點、標記基因、目的基因。(2)在進行PCR擴增β酪蛋白的DNA片段時,應先合成2種不同的引物,在PCR擴增時不同的引物與模板DNA發生堿基互補配對,在引物作用下,DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈,即DNA的合成方向是從子鏈的5'端向3'端延伸的。所以在PCR儀中加入的引物的堿基序列為5'TTCGCTTCT3'、5'TCCTTCCTG3'。(3)若要獲得能生產β酪蛋白的山羊,可采用核移植技術,即將能夠產生綠色熒光乳腺細胞的細胞核移入山羊的MⅡ中去核卵母細胞中獲得重組細胞,并將該重組細胞在體外培養到桑葚胚或囊胚,再經過胚胎移植等獲得能生產β酪蛋白的山羊。在進行體外胚胎培養時所需的氣體環境是95%的空氣和5%的CO2形成的混合氣體。(4)檢測目的基因甲是否導入成功,利用PCR技術可以檢測山羊的染色體DNA上是否插入了甲;甲是否轉錄出了相應的mRNA。4.(2024·湖南懷化二模)(12分)抗菌肽是一類具有廣譜抗菌、抗病毒等功能的小分子多肽,細菌不易對其產生耐藥性且無殘留等,被認為是理想的抗生素替代品。為了突破抗菌肽在畜禽養殖業廣泛應用的瓶頸,我國研究人員運用小分子泛素蛋白(SUMO)融合技術將含有重組抗菌肽LLv基因的質粒導入大腸桿菌,表達融合蛋白SUMOLLv,并優化了表達條件,從而能高效獲得重組抗菌肽LLv。所用質粒含有卡那霉素抗性基因(KanR)、LacZ基因及SacⅠ、XhoⅠ酶切位點等,其結構和構建重組質粒的過程如圖1所示。據此分析回答以下問題。圖1圖2注:LacZ基因編碼產生的β半乳糖苷酶可以分解Xgal產生藍色物質,使菌落呈現藍色;否則菌落為白色。(1)擴增LLv基因時,PCR反應體系中含有的酶有;已知該基因序列不含圖1中限制酶的識別序列,為了使其能與已被酶切的質粒連接,需根據設計引物。

(2)LLv基因以a鏈為轉錄模板鏈,轉錄時mRNA自身的延伸方向為5'→3'。該基因內部沒有SacⅠ、XhoⅠ這兩種酶切位點。圖1中酶切位點1和2所對應的酶分別是。

(3)將重組質粒導入大腸桿菌時,需用CaCl2處理大腸桿菌,其目的是

。

(4)為了將成功導入重組質粒的大腸桿菌篩選出來,甲同學在添加了卡那霉素、Xgal等成分的培養基中進行接種,結果如圖2,該同學采用的接種方法是。圖2中出現的菌落即成功導入重組質粒的大腸桿菌菌落,判斷的理由是

。

答案(1)耐高溫的DNA聚合酶LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhoⅠ的識別序列(2)XhoⅠ、SacⅠ(二者順序不可調換)(3)使大腸桿菌變為感受態細胞,便于從周圍環境吸收DNA分子(4)稀釋涂布平板法白色目的基因(或LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結構,使其不能正常表達形成β半乳糖苷酶,不能分解底物Xgal產生藍色物質解析(1)PCR技術的基本原理是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下,依賴于TaqDNA聚合酶的酶促合成反應,即擴增LLv基因時,PCR反應體系中含有的酶有耐高溫的DNA聚合酶。PCR過程需要兩種引物,能分別與目的基因兩條鏈的3'端通過堿基互補配對結合。目的基因需要與質粒進行連接,但已知LLv基因序列不含圖1中限制酶(SacⅠ、XhoⅠ)的識別序列,為了使LLv基因能與被酶切的質粒連接,需要根據LLv基因兩端的部分核苷酸序列和SacⅠ、XhoⅠ的識別序列設計引物。(2)LLv基因以a鏈為轉錄模板鏈,轉錄時mRNA自身的延伸方向為5'→3',DNA模板被轉錄方向是從3'→5',即圖1中酶切位點1對應的酶為XhoⅠ,酶切位點2對應的酶為SacⅠ。(3)將目的基因導入微生物細胞,常用Ca2+處理微生物,使微生物細胞處于感受態,便于從外界環境吸收DNA分子。(4)分析菌落分布可知,采用的接種方法是稀釋涂布平板法。為了將成功導入重組質粒的大腸桿菌篩選出來,甲同學在添加了卡那霉素、Xgal等成分的培養基中進行接種,目的基因(LLv基因)的插入破壞了LacZ基因的結構,使其不能正常表達形成β半乳糖苷酶,底物Xgal不會被分解,不能產生藍色物質使菌落為白色,因此圖2中出現的白色菌落即成功導入重組質粒的大腸桿菌菌落。5.(2024·山東濟寧二模)(10分)某種小麥的雄性不育由核基因M控制,其整個花藥在發育早期停止發育進程,因此其雄性不育比較徹底。研究發現所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列,且M及其等位基因的編碼區相同;為研究該序列與雄性不育之間的關系,科研人員在野生型小麥中獲得了M等位基因的啟動子并利用Ti質粒構建表達載體,表達載體TDNA部分結構如圖1所示,GFP表達后會發出綠色熒光。將不同表達載體轉入幼胚獲得轉基因小麥,分別對核不育小麥、野生型小麥及轉基因小麥的表型和M基因表達情況進行檢測,部分結果如表。圖1組別實驗材料載體組成Ⅰ、Ⅱ植株表型M基因表達情況第一組核不育小麥無雄性不育eg第二組野生型小麥無可育fg第三組野生型小麥ad死亡第四組野生型小麥①

②

eg注:a.通用的強啟動子;b.M等位基因啟動子;c.插入TRIM序列的M等位基因啟動子;d.M編碼區;e.僅在花藥發育早期表達;f.在花藥發育各時期均不表達;g.在根、莖、葉、雌蕊中均不表達。(1)表中①處應分別選擇(填表注中字母序號),②處植株表型是,結果發現在存活的轉基因小麥花藥中均能檢測到綠色熒光。根據實驗結果推測,導致雄性不育的原因是

。

(2)實驗過程中(填“需要”或“不需要”)設置將bd導入野生型小麥的實驗組,理由是

。

(3)科研人員為檢測(1)中TDNA插入受體細胞染色體中的位置,利用反向PCR技術對插入位點兩側序列進行了分析,過程如圖2。已知TDNA的一條單鏈序列為:5'GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA3'(虛線處省略了部分核苷酸序列)。應選下列引物中的(填序號)用于步驟Ⅲ,引物的作用是

。

A.5'CGCGAGTACT3'B.5'GCGCTCATGA3'C.5'CGTAGCCTCT3'D.5'TACGCATTGC3'圖2答案(1)c、d雄性不育TRIM序列的插入引起啟動子序列改變,導致M基因在花藥發育早期表達(2)不需要野生型小麥本身具有bd,不需要另外導入(3)BD使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸解析(1)本實驗的目的是研究TRIM序列與雄性不育之間的關系,因此野生型小麥需要選擇插入TRIM序列的M等位基因啟動子,即c,TRIM序列的M等位基因啟動子的作用是啟動M基因的表達,因此在構建載體組成Ⅰ、Ⅱ時需要在插入TRIM序列的M等位基因啟動子之后加入M編碼區,故表中①處應分別選擇c、d。已知所有的雄性不育植株都特異性地攜帶了TRIM序列,且第一組實驗結果和第四組的實驗結果中M基因表達情況是相同的,因此②處植株表型是雄性不育。第二組實驗野生型小麥M基因在花藥發育各時期均不表達,在根、莖、葉、雌蕊中均不表達,而第四組和第一組雄性不育植株中M基因僅在花藥發育早期表達,在根、莖、葉、雌蕊中均不表達,綜上推測導致雄性不育的原因是TRIM序列的插入引起啟動子序列改變,導致M基因在花藥發育早期表達。(2)由于野生型小麥本身具有bd,不需要另外導入b和d。(3)反向PCR技術指的是擴增TDNA的兩側序列,以TDNA的一條單鏈序列5'GCAATGCGTAGCCTCT……AACTATGCGCTCATGA3'為模板,擴增其5'一側序列,因此對應的引物是5'TACGCATTGC3',以TDNA的另一條單鏈序列3'CGTTACGCATCGGAGA……TTGATACGCGAGTACT5'為模板,擴增其5'一側序列,因此對應的引物是5'GCGCTCATGA3',故選BD。引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接脫氧核苷酸。6.(2024·福建三明一模)(10分)表觀遺傳調節異常是腫瘤發生發展的重要因素之一,N6甲基腺苷(m6A)是真核生物mRNA上最常見的一種修飾。研究發現,胃癌細胞中存在m6A去甲基化酶(ALKBH5)過表達和STC2(癌癥相關基因)mRNA的m6A修飾水平降低的異常現象。科研人員利用基因工程技術實現ALKBH5基因沉默和STC2基因的過表達,以研究ALKBH5介導的m6A甲基化修飾對胃癌細胞遷移的影響(其中STC2基因的α鏈為轉錄的模板鏈)。研究人員分別用不同方式處理胃癌細胞,并測得胃癌細胞遷移標志蛋白含量如圖3所示。圖1圖2圖3注:A、B、C、D為四種引物序列;BamHⅠ、HindⅢ、SacⅠ為限制酶。(1)圖1PCR反應體系中需加入4種dNTP、耐高溫的DNA聚合酶、模板和,還需加入引物(選“A、B、C、D”)等。

(2)為達到圖1目的需要對上述引物進行設計,你的設計思路是

。

(3)為確保擴增的準確性,設計的引物不能太短,太短會導致