學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精學必求其心得，業必貴于專精庖丁巧解牛知識?巧學一、篩選菌株1。PCR技術是一種在體外將少量DNA大量復制的技術，PCR技術的原理是：如果DNA片段兩端的序列是已知的，那么采用PCR就可以很容易地將此DNA片段從整個DNA分子中擴增出來。進行PCR需要一段寡聚核苷酸鏈作為引物,它們各自與要擴增的靶DNA片段末端互補，引物與模板DNA相結合并沿模板DNA延伸，以擴增靶DNA序列.PCR技術需要使用耐高溫的DNA聚合酶，這種酶要能夠忍受93℃左右的高溫。深化升華PCR的過程由三個基本反應組成：（熱）變性、復性、延伸,這樣構成一個循環的復制,新合成的DNA鏈又可以作為模板進行下一輪復制，重復3步操作。DNA片段呈2的指數增長，在1～2小時內可完成25～30次的循環，擴增的DNA片段數可增至106～107倍。2。選擇培養基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。二、統計菌落數目1.直接計數法這種方法是指利用特定的細菌計數板或者血細胞計數板,在顯微鏡下計算一定容積樣品中微生物的數量.計數板是一塊特制的載玻片，上面有一個面積為1mm2和高0。1mm的計數室，該計數室又均分成400個小格.測量時將稀釋的樣品滴加在計數板上，蓋上蓋玻片，然后在顯微鏡下數出每個小格所含的細菌的平均數，再按下面的公式求出每毫升樣品所含的細菌數。每毫升原液所含的細菌數＝每小格平均細菌數×400×1000×稀釋倍數要點提示此方法的缺點是分不清活菌和死菌。2.間接計數法稀釋涂布平板法，常用來統計樣品中的活菌數，此法是根據微生物在固體培養基上所形成的一個菌落是由一個細菌繁殖而成的現象進行的，也就是說一個菌落就代表一個細菌。計數時先將待測樣品進行一系列的稀釋,再取一定量的稀釋菌液接種在固體培養基上，使其較均勻地分布，經過一段時間的培養后，統計菌落數目，即可求出原液中的細菌數.疑點突破這種方法計算出的為活菌數目，但是該數目往往比實際數目要小，原因是如果稀釋的倍數不夠大,很可能出現兩個或者更多的細菌在一起共同形成一個菌落的情況,在最后計算時,我們卻是按照一個細菌來計算的。聯想發散還可以用紅細胞法來測量細菌的數目。該法要求先將數目已知的紅細胞與已經稀釋的菌液混合均勻,然后在顯微鏡下觀察一滴菌液，計算出紅細胞和細菌的數目比例,然后根據其比例推算出細菌的數目.由于這種方法偶然性較大，所以可以多觀察幾個視野,然后取平均值。三、設置對照對照實驗是指除了被測試條件之外，其他條件都相同的實驗。設置對照的主要目的是排除實驗組中非測試因素對實驗結果的影響,提高實驗結果的可信度.利用稀釋平板涂布法來統計樣品的活菌數，步驟復雜,測定值可能會受到各種因素的影響,因而一定要設立對照。例如為了排除“培養基中混入了其他含氮物質”這種可能，可以設立一對照組，在該對照組中接種某種不能利用尿素的細菌如大腸桿菌，看一下這種細菌能否在培養基上生長，如果能生長,則說明該培養基中確實混入了其他含氮物質,如果不能生長則說明沒有混入其他含氮物質.知識拓展常用的對照方式有四種:空白對照、自身對照、相互對照和條件對照。(1）空白對照就是不給對照組任何處理，如本實驗中可以將一只培養皿（內有培養基）作為對照組,它可以檢測出培養基是否被污染(目的是排除這種可能）。（2）自身對照是指對照組和實驗組在同一對象上進行，也就是說把對象分成幾部分,分別給予不同的處理.（3)相互對照是指不設對照組,幾個實驗組相互比較.（4）條件對照是指給予對照組一種被證明為有效因素的處理，例如研究者正在研究一種新的抗衰老藥物,實驗組使用這種藥物，條件對照組就用已經被證明有抗衰老作用的維生素E來處理。如果實驗結果相同,則說明該藥物有抗衰老作用,否則就證明沒有。誤區警示不同的微生物培養時所需的溫度和培養時間都不同，不能一概而論。例如細菌一般需要在30~37℃培養1～2天；放線菌一般在25~28℃培養5～7天；霉菌一般在25～28℃培養3～4天。三、實驗設計方案：樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養1.儀器、材料和用具：滅過菌的小鐵鏟、氮源為尿素的培養基、1mL的無菌吸管、無菌水、試管、無菌培養皿、無菌信封、酒精燈、燒瓶、涂布器。2.操作步驟：（1)在富含有機質、pH為接近中性的潮濕土壤中,用無菌小鐵鏟鏟去表層土,迅速鏟取土壤裝入無菌信封，密封。然后在火焰旁稱取土壤10g，倒入燒瓶中，塞好棉塞。（2）將稱取的樣品用無菌水稀釋101、102、103、104、105、106倍,制備成菌液.（3）將上述培養基的9個平板分成3組，分別標記為104、105、106倍,用3支吸管分別吸取對應的菌液,滴入平板后用涂布器涂布。每組另外再設立兩個對照,分別對含有硝酸鹽和尿素（滅菌）、未嚴格滅菌（不含硝酸鹽和尿素）的培養基進行涂布。（4）將平板放在30～37℃的溫度下培養2天，菌落數目穩定后做記錄,算出同一稀釋度的3個平板的菌落平均數。要點提示(1）整個過程中要注意無菌操作，一定要建立“有菌觀念"，知道雜菌無處不在。對不同的器具要選擇不同的滅菌方法.(2）做好標記:整個操作中所用的培養皿、試管、吸管等都很多，因此要事先做好標記，避免混淆。（3）規劃時間：微生物培養實驗都是耗時很長的實驗，因此要事先規劃好時間，以便提高工作效率。（4)實驗完成后，不同的實驗小組要對結果進行比較，如果結果相差很大，一定要分析其原因。問題?探究問題1自生固氮菌是土壤中一種常見菌，以土壤中的腐殖質為營養物質來源,它能夠利用空氣中的氮氣合成自身能夠利用的氨，試探究其分離方法。思路:由題目提供的材料可知，自生固氮菌是異養微生物，因此培養基中必須添加有機碳源；一般微生物都不能直接利用氮氣，而自生固氮菌可以利用氮氣，利用這一特點可以配制選擇培養基分離自生固氮菌。探究：配制固體培養基，其中加入有機碳源如葡萄糖、生長因子、水、無機鹽,但一定要注意培養基內不能含有氮元素，滅菌后用涂布器涂布土壤稀釋液，放在30℃下培養4天，培養基上所生菌落即是自生固氮菌的菌落。問題2培養基滅菌不徹底或者滅菌后使用之前被雜菌污染都能影響實驗結果，試探究怎樣鑒別培養基中是否有雜菌。思路：如果培養基中含有雜菌,那么在適宜的環境中它能繁殖而形成菌落.探究：將待檢測培養基放在恒溫箱內（35℃）培養2～4天，如果培養基上長出菌落，則說明培養基中含有雜菌，否則就沒有雜菌，可以放心使用.典題?熱題例1在微生物學中,將允許特定種類的微生物生長，同時又能抑制或者阻止其他種類微生物生長的培養基稱作（）A.鑒別培養基 B.加富培養基C.選擇培養基 D。基礎培養基解析：考查培養基的分類.基礎培養基是含有一般微生物生長繁殖所需基本營養物質的培養基，例如牛肉膏蛋白胨培養基；加富培養基一般用來培養營養要求比較苛刻的異養型微生物；鑒別培養基是在培養基中加入某種特殊的化學物質，微生物的代謝產物能與該物質產生特定的化學反應，產生明顯的特征變化，如出現某種特定顏色等，從而鑒別出微生物種類；選擇培養基是在培養基中加入某種物質，促進需要的微生物生長、抑制不需要的微生物生長，從而選擇出某種微生物。答案:C拓展延伸培養基的分類標準有很多，因此類別也很多,不同類別的培養基所培養的微生物的種類和生長狀況都是不同的，例如液體培養基常用于工業生產，而觀察菌落就只能用固體培養基,分離菌種常用選擇培養基，發酵工程常用天然培養基等。例2能夠測定樣品活菌數的方法是()A.稀釋涂布平板法 B.直接計數法C。重量法 D.比濁法解析：考查各種計數方法的區別。直接計數法是利用計數板，在顯微鏡下計算出微生物的數量，該法不能區分死菌與活菌；重量法又分成干重和濕重法，主要用于測定微生物的群體生長量，也不能區分菌的死活;比濁法的原理是在一定范圍內，菌液的濃度和渾濁度成正比，即與光密度成正比，該法也不能區分菌的死活;平板涂布法是先讓細菌形成菌落，然后根據菌落數推算菌數的方法，由于只有活菌能形成菌落，因此該法能測定樣品活菌數。答案：A.巧妙變式統計菌落數目的方法有(）①涂布平板法②重量法③直接計數法④比濁法⑤生理指標法⑥膜過濾法A.①②③⑥ B。③④⑤⑥ C.①D。①③解析:考查微生物的計數方法,解答時要抓住“菌落”這個關鍵要求。答案：C例3在做土壤中分解尿素的細菌的分離與計數實驗時,甲組用氮源只有尿素的培養基，乙組實驗用氮源除尿素外還有硝酸鹽的培養基,其他的成分都相同，在相同的條件下培養、觀察。乙組實驗為（）A。空白對照 B。標準對照C.相互對照 D.條件對照解析：考查對照的分類。本實驗的目的應該是證明只有分解尿素的細菌才能利用尿素，其他細菌不能利用尿素。由于硝酸鹽是常用的氮源，這一點是已知的，因此該對照應該是條件對照。答案:D方法點撥在解析對照實驗的作用時，一定先要根據實驗目的，比較出實驗組和對照組的不同因素，一般情況下這一因素就是單因子變量（有時也不是)，然后再確定對照的類型和所起的作用.例4某同學用101、102、103倍稀釋液涂布平板時得到的平均菌落數為2760、295、和46，則菌落總個數為（）A.2。76×104個/mLB。2。95×104個/mLC.4.6×104個/mLD.3。775×104個/mL解析:對菌落計數時,要選擇平板的平均菌落數在30～300個之間的稀釋倍數，當只有一個稀釋倍數符合此條件時，則對應平板的菌落數乘以稀釋倍數就是該樣品的細菌總數,若兩個稀釋倍數