一、色譜分離技術的概念

色譜（chromatography）分離技術是一類分離方法的總稱，又稱色譜法、層析法、層離法等。它是利用不同組分在固定相和流動相中的物理化學性質的差別，使各組分在兩相中以不同的速率移動而進一步分離的技術。第7章色譜分離技術第一節概述色譜現象In1903，俄國植物學家MichaelTsweett’sWork(seeBer.Deut.Botan.Ges.,1906;24:384).Chromatography=(chromatus=color,graphein=towrite).圖示固定相——CaCO3顆粒流動相——石油醚

色帶一、色譜過程

色譜柱檢測器色譜圖

組分在色譜柱內運動溶質濃度分布柱內：譜帶柱后：色譜峰色譜儀1.定義

色譜是根據混合物中溶質在互不混溶的兩相間分配行為的差別而引起移動速度的不同而進行分離的方法。2.色譜法的特點分離效率高可選操作參數多應用范圍廣高靈敏度的在線檢測快速分離與過程自動化操作在色譜過程中，分配系數大的溶質在固定相上存在的概率大，隨流動相移動速度小。由此，溶質之間由于移動速度的不同而得到分離。

色譜操作中互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動相。固定相填充于柱內形成固定床，在柱的入口端加入料液后，連續輸入流動相，料液中溶質在流動相與固定相之間擴散傳質，產生分配平衡3.色譜一般過程在色譜法中，表面積較大的固體或附著在固體上且不運動的液體，靜止不動的一相（稱為固定相

；自上而下運動的一相（一般是氣體或液體）稱為流動相。二、色譜分離系統的組成根據分離時一次進樣量的多少，色譜分離的規模可分為色譜分析規模(小于10mg)、半制備(10~50mg)、制備規模(0.1~10g)和工業生產規模(>10g)。色譜分離的規模小，但產值高。三、色譜分離技術的分類

超臨界流體色譜—流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體三、色譜法的分類根據流動相的相態不同:氣相色譜—以氣體作流動相液相色譜—以液體作流動相—固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄層色譜三、色譜法的分類根據固定相的附著方式分類

—液體固定相涂在紙上—紙色譜(平板色譜)—固定相裝在圓柱管中—柱色譜三、色譜法的分類吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法按分離機理不同，可分為：三、色譜法的分類根據操作壓力的不同分類：低壓色譜：操作壓力<0.5MPa中壓色譜：操作壓力0.5～4.0MPa高壓色譜：操作壓力4.0～40MPa

色譜法的缺點是處理量小、操作周期長、不能連續操作。四、色譜法的特點(1)分離效果高(2)應用范圍廣(3)選擇性強(4)設備簡單第二節

吸附色譜法吸附色譜法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶質與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。固體吸附劑，如有較強極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭及特殊作用的分子篩等。吸附色譜是靠溶質與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附力主要是范德華力，有時也可能形成氫鍵或化學鍵。吸附法的關鍵是選擇吸附劑和展開劑。1.基本原理吸附色譜分離過程示意圖

下列三個化合物用硅膠吸附色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脫，判斷三者流出色譜柱先后順序。

ABC由先到后：

C→B→A

舉例：平衡系數（分配系數、吸附系數、選擇性系數）K=cs/cm

cs—固定相中的濃度；cm—流動相中的濃度影響K的因素：被分離物質本身的性質、固定相和流動相的性質、色譜柱的操作溫度。各物質K差異越大，色譜分離效果越理想。阻滯因數（比移值）

斑點到原點的距離

Rf值=————————

溶劑前沿到原點距離阻滯因數①0≤Rf≤1Rf越大，溶質隨流動相移動快，被洗脫速率也就越快。②當Rf=1，此種溶質不溶于固定相，隨流動相以同樣的速率移動。③當Rf=0，此種溶質不溶于流動相，而被吸附在固定相上。選用吸附色譜法分離化合物時，必須首先了解被分離化合物的性質，然后選擇合適的吸附劑和展開劑。被分離化合物、吸附劑和展開劑三者關系配合恰當才能得到較好的分離效果。2.吸附劑與展開劑薄層色譜法選擇的主要吸附劑為氧化鋁、硅膠和聚酰胺。色譜用的吸附劑要求一定的形狀與粒度范圍，不同吸附劑用于分離不同類型的化合物。吸附劑還必須具有一定的活度，活度太高或過低都不能使混合物各組分得到有效的分離。（1）薄層色譜的吸附劑與展開劑展開劑基本原則主要有兩個：①展開劑對被分離組分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展開劑應該對被分離的物質有一定的溶解度。展開劑常用溶劑極性次序為：己烷<環己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸吸附劑應有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對欲分離的不同物質應該有不同的解吸能力；與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會發生化學反應；吸附劑顆粒均勻，操作過程中不會破裂。（2）柱色譜的吸附劑與洗脫劑吸附劑的選擇洗脫劑的選擇原則上要求所選的洗脫劑純度合格，與樣品和吸附劑不起化學反應，對樣品的溶解度大，粘度小，容易流動，容易與洗脫的組分分開。洗脫劑的選擇常用的洗脫劑有飽和的碳氫化合物、醇、酚、酮、醚、鹵代烷、有機酸等。選擇吸附劑時，可根據樣品的溶解度、吸附劑的種類、溶劑極性等方面考慮先用極性小的作洗脫劑，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分容易從吸附柱中洗出。3.影響吸附分離的因素①和功能基極性有關。極性增加的順序：烷烴、不飽和烴、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一類化合物極性基團越多，極性越大。②小分子的化合物比大分子的化合物極性大。③和某些細微結構有關，如氫鍵、異構體等。二、吸附色譜分離操作及其設備1.薄層吸附色譜分離操作及設備（1）薄層色譜板的制備（2）點樣（3）展開（4）顯色①干法鋪板(軟板制備)

多用于氧化鋁薄層板的制備。在一塊邊緣整齊的玻璃板上，鋪上適量的氧化鋁，取一合適物品頂住玻璃板右端。兩手緊握鋪板玻璃棒的邊緣，按箭頭方向輕輕拉過，一塊邊緣整齊、薄厚均勻的氧化鋁薄層即成。(1)薄層色譜板的制備干法制板可用于硅膠、聚酰胺、氧化鋁等薄層板的制備，但最常用的是硅膠硬板。為使制成的硅膠板堅硬，要加入黏合劑，用硫酸鈣為粘合劑鋪成的板稱為硅膠G板，用羧甲基纖維素鈉作黏合劑鋪成的板為硅膠-CMC板。(2)濕法鋪板(硬板制備)聚酰胺膜多為外購商品。2)點樣

用一根玻璃毛細管或點樣器，吸取樣品溶液，在距薄層一端約2cm的起始線上點樣，每點間距約2cm，樣品點直徑一般小于0.5cm。注意點樣量要適中，太少時，某些成分不能被檢出；太多時容易產生拖尾現象，即每個斑點都拉得很長，互相重疊，不能分開。3）展開展開操作需要在密閉的容器中進行。展開劑配好（2～10mL）倒入層析缸。放置一定時間，待層析缸被展開劑飽和后，再迅速將薄層板放入，密閉，展開即開始，這樣可防止邊緣效應產生。薄板放入層析缸時，切勿使溶劑浸沒樣品點。當溶劑移動到接近薄層上端邊緣時，取出薄板，劃出溶劑前沿。展開方式可分三類：(1)上行展開法最常用

就是使展開劑從下往上爬行展開；(2)單次展開法和多次展開法(3)單向展開法和雙向展開法

薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板薄層色譜法(Thin

Layer

Chromatography)4)顯色顯色也稱定位，即用某種方法使經色譜展開后的混合物斑點呈現顏色，以便觀察其位置(1)

紫外線照射法(4)

生物顯跡法(2)

噴霧顯色法(3)

碘蒸汽顯色法2.吸附柱色譜分離操作及設備洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱色譜柱通常用玻璃柱。工業上用金屬制造。柱入口端應該有進料分布器，使進入柱內的流動相分布均勻。色譜柱頂端加一層多孔的尼龍圓片或保持一段緩沖液層。柱底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板，最簡單的也可以用鋪有濾布的橡皮塞。(1)色譜柱的選擇設計柱長時需考慮下列幾點：(3)柱越長，長度和內徑比越大，就越難得到均勻的填裝。大多數色譜柱的長度25cm左右。(1)柱的最小長度取決于所要達到的分離程度(2)較大的柱直徑需要較長的色譜柱。①干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉，再輕輕地撒上一層5mm厚的干凈砂粒，或放置大小合適的玻璃砂芯。打開下口，然后將吸附劑經漏斗緩緩加入柱中，同時輕輕敲動色譜柱，使吸附劑松緊一致將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入，至剛好覆蓋吸附劑頂端平面，關緊下口活塞。(2)裝柱②濕法裝柱吸附劑中加入適量洗脫劑調成稀糊狀，

再把放好棉花或玻璃砂芯的色譜柱下口打開，然后徐徐將制好的糊漿灌入柱子。操作要慢，不要將氣泡壓入吸附劑中，而且要始終保持吸附劑上有溶劑，最后讓吸附劑自然下沉。當洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時，關緊下口活塞。(3)上樣①濕法上樣

把被分離的物質溶在少量洗脫劑中，小心加在吸附劑上層，注意保持吸附劑上表面仍為一水平面打開下口，待溶液面正好與吸附劑上表面一致時，在上面撒一層細砂，關緊柱活塞。②干法上樣可選用一種對樣品溶解度大而且沸點低的溶劑，取盡可能少的溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑，拌勻，揮干溶劑，研磨使之成松散均勻的粉末，輕輕撒在色譜柱吸附劑上面，再撒一層細砂。(4)洗脫在裝好吸附劑的色譜柱中緩緩加入洗脫劑，進行剃度洗脫，各組分先后被洗出。若用50g吸附劑，一般每份洗脫液量常為50mL。現多采用薄層色譜或紙色譜定性檢查各流分中的化學成分組成。含單一色點的部分用合適的溶劑結晶；仍為混合物的部分進一步尋找分離方法再進行分離。注意：整個操作過程必須注意不使吸附柱表面的溶液流干。應控制洗脫液的流速。應盡量在短時間內完成一個柱層析的分離。洗脫操作的方式可分為：前沿分析法（迎頭法）：將混合物溶液連續通過色譜柱，只有吸附力量最弱的組分最先自柱中流出，其他各組分不能達到分離。置換展開法（頂替法）：利用一種吸附力比各組分都強的溶劑作為洗脫劑，替代結合在固定相上的各組分。處理量大，且各組分分層清楚。洗脫展開法（洗脫分析法）：先將混合物盡量濃縮，引入色譜柱上部，然后用溶劑洗脫，使各組分分離完全。應用最廣。三、吸附色譜法的應用主要用于具有不同官能團或具有相同官能團但數目不同的極性化合物及異構體等生物小分子物質的分離分析。第三節

凝膠色譜法凝膠色譜是基于分子大小不同而進行分離的一種分離技術，又稱凝膠過濾、凝膠滲透過濾、分子篩過濾、阻滯擴散層析或排阻層析。優點：操作方便、不會使物質變性、適用于不穩定的化合物、凝膠不用再生、可反復使用。缺點：分離速度較慢。一、基本原理小分子物質可在凝膠顆粒間隙中擴散外，還可以進入凝膠顆粒的微孔中，如此不斷地進入和擴散，小分子物質的下移速度落后于大分子物質，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現象叫分子篩效應。凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質凝膠珠二、凝膠過濾介質理想的凝膠過濾介質具有高物理強度及化學穩定性，能夠耐受高溫高壓和強酸強堿，具有高化學惰性，內孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是應用最廣泛的一類凝膠，國外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯而得。交聯劑在原料總質量中所占的百分數叫交聯度。交聯度越大，網狀結構越緊密，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯度越小，網狀結構越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達到的。瓊脂糖凝膠的化學穩定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。3.聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，其穩定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時不會有凝膠物質被洗脫下來。在pH2~11范圍穩定。缺點是不耐酸，遇酸時酰胺鍵會水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團。三、凝膠過濾介質的選擇1.分離范圍2.分辨率3.穩定性四、操作方法1.凝膠的預處理市售凝膠必須經過充分溶漲后才能使用，如果溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過細的粒子。如此反復多次，直至上層澄清為止。2.層析柱的選擇層析柱的體積和高徑比與層析分離效果的關系相當密切。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度。3.凝膠柱的裝填空柱中應留1/5的水或溶劑。所用凝膠必須是經過充分溶漲的。開始進膠后應當打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結，對分離不利。進膠過程必須連續、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。4.樣品處理和加樣分離蛋白質樣品的體積為凝膠床的1-4％一般約0.5-2ml在蛋白質溶液除鹽時，樣品可達凝膠床的20-30％。分級分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。4.樣品處理和加樣加樣時盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動。直接將樣品加到層析床表面5.洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復性下降，整個洗脫過程中始終保持一定的操作壓。流速不宜太快且要穩定。洗脫液的成分也不應改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。6.凝膠的保存(1)干法(2)濕法(3)半縮法第四節親和色譜親和色譜(affinitychromatography，AFC)利用固定相配基與生物大分子之間的特殊生物親和力的不同實現分離的。親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細胞、細胞器、病毒等物質的分離與純化。特別是對分離含量極少而又不穩定的活性物質最有效，經一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。①選擇性高、特異性極強②操作條件溫和③回收率高親和色譜的局限性①普遍性、通用性不夠②費用高親和色譜的特點1基本原理親和色譜是應用生物高分子物質能與相應專一配基分子可逆結合的原理將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統。生物分子與配體特異結合，具有高度的特異性和親和力。親和層析過程2親和吸附劑的制備1.載體的選擇①載體必須具有較好的理化穩定性和生物惰性，非專業吸附小。②具有大量可供活化和配體結合的化學基團，以供與配體共價連接之用。③載體必須具有高度的水不溶性和親水性。④載體必須有稀松的網狀結構使大分子能自由進入⑤載體要有良好的機械性能，顆粒均勻。1.載體的選擇常用的親和色譜載體

主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯瓊脂糖凝膠載體等。2.配體的選擇根據配基應用和性質，可將其分為兩類：特殊配體和通用配體。特殊配體有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配體可適用于一類物質的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配體。2.配體的選擇首先，應當僅僅識別被純化的目的物。其次，配體與配基應該有足夠大的親和力。再次，配體與相應目的物之間的結合應具有可逆性。第四，配體具有足夠的穩定性，能夠耐受反應條件以及清洗合再生等條件。最后，配體的分子大小必須合適。3.載體的活化與偶聯載體由于其相對的惰性，往往不能直接與配體連接，偶聯前一般需先活化，載體表面經過活化后產生的活性基團可以在簡單的化學條件下與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團發生共價結合反應，這一過程稱為配體的鍵合。載體表明的基團必須具有通用性合高效性，可以與上述配體上的常見基團發生簡單、快速的反應。3.載體的活化和配體的連接1.溴化腈活化法2.環氧基活化法3.硅膠的活化3影響吸附劑親和力的因素

1.配體濃度對于親和力低的系統，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配體的有效濃度。2.空間障礙在制備有些吸附劑時需要在載體與配體之間插入一段適當長度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配體的活動度并減輕載體的立體障礙。3影響親和作用的因素

3.配體.與載體的結合位點在多肽或蛋白質等大分子作配體時，必須使它以最少的鍵與載體連接。4.載體孔徑載體孔隙是配基向配體接近的運動通道，所以載體的孔徑大小對吸附劑的親和能力有決定性影響。4親和色譜操作條件的選擇1.吸附條件的選擇①吸附反應條件

最好是自然狀態下配體與目的分子之間反應的最佳條件。②流速控制

不能太快③吸附時間的控制

延長時間可促進吸附④進樣量的大小

減少進樣量，可提高吸附效果。4親和色譜操作條件的選擇2