凝膠過(guò)濾層析法測(cè)定蛋白質(zhì)分子量【目的要求】掌握凝膠層析的根本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)技能

【原理】凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被別離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行別離的技術(shù)。相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動(dòng)，因此流程較短，移動(dòng)速度快；所以首先流出。相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，因此流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們?cè)谀z顆粒內(nèi)外局部滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而到達(dá)了別離的目的。圖3-1凝膠層析別離原理示意圖

◎然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲(chǔ)液瓶連接，調(diào)流速3～6mL/10min，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡。例如SephadexG-75吸水率7.對(duì)于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0圖3-1凝膠層析別離原理示意圖例如SephadexG-75床體積12～15ml/g掌握凝膠層析的根本原理相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動(dòng)，因此流程較短，移動(dòng)速度快；小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－Vo分配系數(shù)

表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。對(duì)于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。4〕以Kav值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)lgMr為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1〕取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。它包括自參加樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。【根本概念】

外水體積、內(nèi)水體積、柱床體積、洗脫體積外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。柱床體積是〔Vt〕凝膠柱所能容納的總體積。小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大內(nèi)水體積〔Vi〕：可以通過(guò)測(cè)定完全滲透的小分子溶質(zhì)〔如重鉻酸鉀〕的洗脫體積來(lái)測(cè)定掌握凝膠層析的根本原理Vo和Vt可以通過(guò)測(cè)定得到，測(cè)定了某個(gè)組分的Ve就可以得到這個(gè)組分的分配系數(shù)。外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。掌握凝膠層析的根本原理相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，因此流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢；對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系：分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。一、凝膠的選擇和處理是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被別離物質(zhì)的分子大小不同來(lái)進(jìn)行別離的技術(shù)。床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積對(duì)于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積圖3-1凝膠層析別離原理示意圖【根本概念】洗脫體積〔Ve〕是指將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。它包括自參加樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。

Ve一般是介于Vo和Vt之間的。

對(duì)于完全排阻的大分子由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)，故其洗脫體積Ve＝Vo對(duì)于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故其洗脫體積Ve＝Vt分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。一、凝膠的選擇和處理對(duì)于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1它包括自參加樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。五、未知樣品蛋白質(zhì)分子量的測(cè)定分配系數(shù)

表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。將待測(cè)待測(cè)雞卵粘蛋白樣品配制成5mg/mL溶液,以下步驟完全按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件操作。對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系：圖3-1凝膠層析別離原理示意圖小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav是判斷別離效果的一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)也是測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的一個(gè)依據(jù)。分配系數(shù)

表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。通過(guò)將一些分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定Ve或Kav，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下測(cè)定未知樣品的Ve或Kav，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子質(zhì)量。4〕以Kav值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)lgMr為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖3-3

凝膠層析柱洗脫曲線示意圖Ⅰ完全排阻的大分子Ⅱ中等分子Ⅲ完全滲透的小分子

洗脫體積的測(cè)定外水體積〔Vo〕：可以通過(guò)測(cè)定完全排阻的大分子物質(zhì)的洗脫體積來(lái)測(cè)定，一般常用藍(lán)色葡聚糖-2000作為測(cè)定外水體積的物質(zhì)。內(nèi)水體積〔Vi〕：可以通過(guò)測(cè)定完全滲透的小分子溶質(zhì)〔如重鉻酸鉀〕的洗脫體積來(lái)測(cè)定即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－Vo柱床體積〔Vt〕：1)可用下式計(jì)算：Vt＝π×〔D/2〕2×h2〕根據(jù)Vt＝Vo＋Vi可以得到3〕參加一定量的水至層析柱預(yù)定標(biāo)記處，然后測(cè)量水的體積。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，因此流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢；分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內(nèi)水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－VoVe＝－b’lgMr+c’掌握凝膠層析的根本原理掌握凝膠層析的根本原理例如SephadexG-75床體積12～15ml/g例如SephadexG-75吸水率7.代入公式計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Kav值。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。分配系數(shù)

表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。圖3-1凝膠層析別離原理示意圖分配系數(shù)

表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。

Vo

和Vt可以通過(guò)測(cè)定得到，測(cè)定了某個(gè)組分的Ve就可以得到這個(gè)組分的分配系數(shù)。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先從柱中流出→Ve值小→Kav值小小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav

＝Ve

－

VoVt

－Vo

Kav值的大小和凝膠柱床的總體積〔Vt〕、外水體積〔Vo〕以及別離物本身的洗脫體積〔Ve〕有關(guān)。對(duì)于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0對(duì)于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1Kav是判斷別離效果的一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)也是測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的一個(gè)依據(jù)。對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系：Kav＝－blgMr+c由于Ve和Kav也成線性關(guān)系所以同樣有：Ve＝－b’lgMr+c’通過(guò)將一些分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定Ve或Kav，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下測(cè)定未知樣品的Ve或Kav，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子質(zhì)量。吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。SephadexG-25～200數(shù)字是吸水率×10例如SephadexG-75吸水率7.5±m(xù)l/g床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積例如SephadexG-75床體積12～15ml/g干膠用量(g)=柱(ml)床體積/凝膠床體積(ml/g)【應(yīng)用】生物大分子的純化分子量測(cè)定脫鹽及去除小分子雜質(zhì)去熱源物質(zhì)溶液的濃縮【操作方法】一、凝膠的選擇和處理量取110mLSephadexG-75于250mL燒杯中，參加洗脫液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆粒空隙中的空氣。二、裝柱1〕取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺(tái)上。2〕凝膠柱床總體積〔Vt〕的測(cè)定：在距柱上端約5㎝處作一記號(hào)，關(guān)閉柱出水口，參加蒸餾水，翻開出水口，液面降至柱記號(hào)處即關(guān)閉出水口，然后用量筒接收柱中蒸餾水，讀出的體積即為柱床總體積Vt。3〕向柱內(nèi)參加約1/4柱體積的洗脫液，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約2～3㎝高度后翻開出水口，待膠面上升到柱記號(hào)處時(shí)那么裝柱完畢。然后關(guān)閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲(chǔ)液瓶連接，調(diào)流速3～6mL/10min，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡。三、Vo的測(cè)定翻開柱上端的塞子，待柱內(nèi)洗脫液下降至與凝膠膠面相切時(shí)，關(guān)閉出水口。用細(xì)滴管吸取1mL藍(lán)色葡聚糖-2000液，小心地繞柱壁一圈〔距膠面2mm〕緩慢參加，翻開出水口〔開始收集〕，待溶液完全滲入柱床后，關(guān)閉出水口，取1mL洗脫液沿管壁洗柱一次，等溶液完全滲入柱床，柱上端再參加幾毫升洗脫液，將柱上端接口與儲(chǔ)液瓶連接，翻開出水口，開始洗脫。收集藍(lán)色葡聚糖-2000洗脫峰，測(cè)出洗脫體積Ve，得出Vo值。

1〕用洗脫液配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液〔牛血清蛋白、雞卵清蛋白、溶菌酶〕。2〕按上述方法參加1mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合液，以3mL/10min的速度洗脫并收集洗脫液體積。3〕分別收集各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫峰〔靈敏度0.2A〕，測(cè)量它們的洗脫體積Ve。代入公式計(jì)算出各標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Kav值。4〕以Kav值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)lgMr為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作五、未知樣品蛋白質(zhì)分子量的