凝膠過濾層析法測定蛋白質分子量【目的要求】掌握凝膠層析的根本原理學習利用凝膠層析法測定蛋白質相對分子質量的實驗技能

【原理】凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被別離物質的分子大小不同來進行別離的技術。相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，因此流程較短，移動速度快；所以首先流出。相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可完全滲透進入凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們在凝膠顆粒內外局部滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而到達了別離的目的。圖3-1凝膠層析別離原理示意圖

◎然后關閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲液瓶連接，調流速3～6mL/10min，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡。例如SephadexG-75吸水率7.對于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0圖3-1凝膠層析別離原理示意圖例如SephadexG-75床體積12～15ml/g掌握凝膠層析的根本原理相對分子質量較大的物質由于直徑大于凝膠網孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，因此流程較短，移動速度快；小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－Vo分配系數

表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。對于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。4〕以Kav值為橫坐標，標準蛋白質lgMr為縱坐標，繪出標準曲線。1〕取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。它包括自參加樣品時算起，到組分最大濃度出現時所流出的體積。【根本概念】

外水體積、內水體積、柱床體積、洗脫體積外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。柱床體積是〔Vt〕凝膠柱所能容納的總體積。小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大內水體積〔Vi〕：可以通過測定完全滲透的小分子溶質〔如重鉻酸鉀〕的洗脫體積來測定掌握凝膠層析的根本原理Vo和Vt可以通過測定得到，測定了某個組分的Ve就可以得到這個組分的分配系數。外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。掌握凝膠層析的根本原理相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可完全滲透進入凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；對于某一型號的凝膠，在一定的分子質量范圍內，各個組分的Kav與其分子質量的對數成線性關系：分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。一、凝膠的選擇和處理是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被別離物質的分子大小不同來進行別離的技術。床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積對于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積圖3-1凝膠層析別離原理示意圖【根本概念】洗脫體積〔Ve〕是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。它包括自參加樣品時算起，到組分最大濃度出現時所流出的體積。

Ve一般是介于Vo和Vt之間的。

對于完全排阻的大分子由于其不進入凝膠顆粒內，故其洗脫體積Ve＝Vo對于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個體積內，故其洗脫體積Ve＝Vt分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。一、凝膠的選擇和處理對于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1它包括自參加樣品時算起，到組分最大濃度出現時所流出的體積。五、未知樣品蛋白質分子量的測定分配系數

表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。將待測待測雞卵粘蛋白樣品配制成5mg/mL溶液,以下步驟完全按照標準曲線的條件操作。對于某一型號的凝膠，在一定的分子質量范圍內，各個組分的Kav與其分子質量的對數成線性關系：圖3-1凝膠層析別離原理示意圖小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav是判斷別離效果的一個重要參數，同時也是測定蛋白質分子質量的一個依據。分配系數

表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。通過將一些分子質量的標準蛋白質在同一凝膠柱上以相同條件進行洗脫，分別測定Ve或Kav，并根據上述的線性關系繪出標準曲線，然后在相同條件下測定未知樣品的Ve或Kav，通過標準曲線即可求出其分子質量。4〕以Kav值為橫坐標，標準蛋白質lgMr為縱坐標，繪出標準曲線。

圖3-3

凝膠層析柱洗脫曲線示意圖Ⅰ完全排阻的大分子Ⅱ中等分子Ⅲ完全滲透的小分子

洗脫體積的測定外水體積〔Vo〕：可以通過測定完全排阻的大分子物質的洗脫體積來測定，一般常用藍色葡聚糖-2000作為測定外水體積的物質。內水體積〔Vi〕：可以通過測定完全滲透的小分子溶質〔如重鉻酸鉀〕的洗脫體積來測定即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－Vo柱床體積〔Vt〕：1)可用下式計算：Vt＝π×〔D/2〕2×h2〕根據Vt＝Vo＋Vi可以得到3〕參加一定量的水至層析柱預定標記處，然后測量水的體積。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積相對分子質量較小的物質由于直徑小于凝膠網孔，可完全滲透進入凝膠顆粒的網孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。外水體積〔Vo〕是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積內水體積〔Vi〕是指凝膠顆粒中孔穴的體積。即Ve＝Vo＋Vi推出Vi＝Ve－VoVe＝－b’lgMr+c’掌握凝膠層析的根本原理掌握凝膠層析的根本原理例如SephadexG-75床體積12～15ml/g例如SephadexG-75吸水率7.代入公式計算出各標準蛋白質的Kav值。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。分配系數

表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。圖3-1凝膠層析別離原理示意圖分配系數

表示某個組分在內水體積和在外水體積中的濃度分配關系。

Vo

和Vt可以通過測定得到，測定了某個組分的Ve就可以得到這個組分的分配系數。在一定的條件下，Vt和Vo都是恒定值。大分子先從柱中流出→Ve值小→Kav值小小分子后從柱中流出→Ve值大→Kav值大Kav

＝Ve

－

VoVt

－Vo

Kav值的大小和凝膠柱床的總體積〔Vt〕、外水體積〔Vo〕以及別離物本身的洗脫體積〔Ve〕有關。對于完全排阻的大分子Ve＝Vo故Kav＝0對于完全滲透的小分子Ve＝Vt故Kav＝1Kav是判斷別離效果的一個重要參數，同時也是測定蛋白質分子質量的一個依據。對于某一型號的凝膠，在一定的分子質量范圍內，各個組分的Kav與其分子質量的對數成線性關系：Kav＝－blgMr+c由于Ve和Kav也成線性關系所以同樣有：Ve＝－b’lgMr+c’通過將一些分子質量的標準蛋白質在同一凝膠柱上以相同條件進行洗脫，分別測定Ve或Kav，并根據上述的線性關系繪出標準曲線，然后在相同條件下測定未知樣品的Ve或Kav，通過標準曲線即可求出其分子質量。吸水率和床體積

吸水率是指1g干的凝膠吸收水的體積或者重量，但它不包括顆粒間吸附的水份。所以它不能表示凝膠裝柱后的體積。SephadexG-25～200數字是吸水率×10例如SephadexG-75吸水率7.5±ml/g床體積指1g干的凝膠吸收水后的最終體積例如SephadexG-75床體積12～15ml/g干膠用量(g)=柱(ml)床體積/凝膠床體積(ml/g)【應用】生物大分子的純化分子量測定脫鹽及去除小分子雜質去熱源物質溶液的濃縮【操作方法】一、凝膠的選擇和處理量取110mLSephadexG-75于250mL燒杯中，參加洗脫液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆粒空隙中的空氣。二、裝柱1〕取潔凈的玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上。2〕凝膠柱床總體積〔Vt〕的測定：在距柱上端約5㎝處作一記號，關閉柱出水口，參加蒸餾水，翻開出水口，液面降至柱記號處即關閉出水口，然后用量筒接收柱中蒸餾水，讀出的體積即為柱床總體積Vt。3〕向柱內參加約1/4柱體積的洗脫液，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約2～3㎝高度后翻開出水口，待膠面上升到柱記號處時那么裝柱完畢。然后關閉出水口，靜置片刻，等完全沉降，將接接口的乳膠管與盛有洗脫液的儲液瓶連接，調流速3～6mL/10min，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡。三、Vo的測定翻開柱上端的塞子，待柱內洗脫液下降至與凝膠膠面相切時，關閉出水口。用細滴管吸取1mL藍色葡聚糖-2000液，小心地繞柱壁一圈〔距膠面2mm〕緩慢參加，翻開出水口〔開始收集〕，待溶液完全滲入柱床后，關閉出水口，取1mL洗脫液沿管壁洗柱一次，等溶液完全滲入柱床，柱上端再參加幾毫升洗脫液，將柱上端接口與儲液瓶連接，翻開出水口，開始洗脫。收集藍色葡聚糖-2000洗脫峰，測出洗脫體積Ve，得出Vo值。

1〕用洗脫液配制標準蛋白質溶液〔牛血清蛋白、雞卵清蛋白、溶菌酶〕。2〕按上述方法參加1mL標準蛋白質混合液，以3mL/10min的速度洗脫并收集洗脫液體積。3〕分別收集各標準蛋白質的洗脫峰〔靈敏度0.2A〕，測量它們的洗脫體積Ve。代入公式計算出各標準蛋白質的Kav值。4〕以Kav值為橫坐標，標準蛋白質lgMr為縱坐標，繪出標準曲線。四、標準曲線的制作五、未知樣品蛋白質分子量的