第七章微生物的生長與控制1第七章微生物的生長與控制生長——微生物細胞吸收營養物質，進行新陳代謝，當同化作用>異化作用時，生命個體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個體生長到一定階段，通過特定方式產生新的生命個體，即引起生命個體數量增加的生物學過程。發育——從生長到繁殖，是生物的構造和機能從簡單到復雜、從量變到質變的發展變化過程，這一過程稱為發育。個體生長——微生物細胞個體吸收營養物質，進行新陳代謝，原生質與細胞組分的增加為個體生長。群體生長——群體中個體數目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況）個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖生長與繁殖的概念2第七章微生物的生長與控制第一節微生物純培養分離及生長測定方法3第七章微生物的生長與控制一、獲得純培養的方法純培養(pureculture)——微生物學中把從一個細胞或一群相同的細胞經過培養繁殖而得到的后代,稱純培養.4第七章微生物的生長與控制首先將待分離的樣品進行連續稀釋,目的是得到高度稀釋的效果,使一支試管中分配不到一個微生物.如果經過稀釋后的大多數試管中沒有微生物生長,那么有微生物生長的試管得到的培養物可能就是由一個微生物個體繁殖而來的純培養物.這種方法適合于細胞較大的微生物.①液體稀釋法5第七章微生物的生長與控制②平板劃線分離法（StreakPlate）特點：快速、方便。

分區劃線（適用于濃度較大的樣品）

連續劃線（適用于濃度較小的樣品）Aninoculatingloopisusedtothinoutorganismsonthesurfaceoftheagar.6第七章微生物的生長與控制連續劃線劃線分離后平板上顯示的菌落照片7第七章微生物的生長與控制③傾注平板法（PourPlate）1ml1ml1ml1ml1ml1ml9ml9ml9ml9ml8第七章微生物的生長與控制④平板涂布分離法（SpreadPlate）簡單易行，但易造成機械損傷Liquidspecimenisspreadonthesurfaceofsolidagarwithasterilebentglassrod.9第七章微生物的生長與控制⑤選擇性培養分離法為了從混雜的微生物群體中分離出某種微生物，可以根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，采用選擇培養的方法進行分離。＊利用選擇培養基進行直接分離＊富集培養10第七章微生物的生長與控制⑥單細胞（單孢子）分離法采用顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養的方法。該方法要在顯微鏡下進行。毛細管法：用毛細管提取微生物個體，適合于較大微生物。顯微操作儀：用顯微針、鉤、環等挑取單個細胞或孢子以獲得純培養。小液滴法：將經過適當稀釋后的樣品制成小液滴，在顯微鏡下選取只含一個細胞的液滴來進行純培養物的分離。11第七章微生物的生長與控制二、微生物純培養生長的測定方法描述不同種類、不同生長狀態的微生物生長情況，需選用不同的測定指標。（一）微生物細胞數目的檢測法直接法（血球計數板）間接法（活菌計數法、膜過濾法）（二）微生物生長量和生理指標測定法直接法(干重法，堆體積法)間接法（比濁法，碳、氮含量法，其它生理指標）12第七章微生物的生長與控制1.血球計數板法13第七章微生物的生長與控制原理：將1cm2×0.1mm的薄層空間劃分為400小格，從中均勻分布地選取80或100小格，計數其中的細胞數目，換算成單位體積中的細胞數。適用范圍：個體較大細胞或顆粒，如血球、酵母菌等。不適用于細菌等個體較小的細胞，因為（1）細菌細胞太小，不易沉降；（2）在油鏡下看不清網格線，超出油鏡工作距離。特點：快速，準確，對酵母菌可同時測定出芽率，或在菌懸液中加入少量美藍可以區分死活細胞。1.血球計數板法14第七章微生物的生長與控制3.平板菌落計數法15第七章微生物的生長與控制2.平板菌落計數法★技術要求：樣品充分混勻，操作熟練快速（15~20min完成操作），嚴格無菌操作；★注意事項：每一支吸管只能用于一個稀釋度，樣品混勻處理，傾注平板時的培養基溫度；★適用范圍：中溫、好氧和兼性厭氧、能在營養瓊脂上生長的微生物，★誤差：多次稀釋造成的誤差是主要來源，其次還有由于樣品內菌體分布不均勻、以及不當操作16第七章微生物的生長與控制4.液體稀釋法10n10n-210n-117第七章微生物的生長與控制4.薄膜過濾計數法常用該法測定含菌量較少的空氣和水中的微生物數目。將定量的樣品通過薄膜（硝化纖維素薄膜、醋酸纖維薄膜）過濾，菌體被阻留在濾膜上，取下濾膜進行培養，然后計算菌落數，可求出樣品中所含菌數。18第七章微生物的生長與控制5.干重法將一定量的菌液中的菌體通過離心或過濾分離出來,然后烘干(干燥溫度可采用105℃、100℃或80℃)、稱重。一般干重為濕重的10%—20%，而一個細菌細胞一般重約10-12—10-13g。該法適合菌濃較高的樣品。舉例：大腸桿菌一個細胞一般重約10–12~10–13g，液體培養物中細胞濃度達到2×109個/ml時，100ml培養物可得10~90mg干重的細胞。19第七章微生物的生長與控制6.比濁法原理是在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。特點：快速、簡便；但易受干擾。20第七章微生物的生長與控制7.生理指標法測含氮量蛋白質是細胞的主要物質，含量穩定，而氮是蛋白質的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據一定體積培養液中的含氮量再乘以6.25，就可測得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產二氧化碳、產酸、產熱、粘度等，都可用于生長量的測定。21第七章微生物的生長與控制第二節微生物的生長規律22第七章微生物的生長與控制由于微生物細胞極其微小，研究其個體生長存在著技術上的困難。同步生長的概念：一個細胞群體中各個細胞都在同一時間進行分裂的狀態，稱為同步生長（synchronousgrowth），進行同步分裂的細胞稱為同步細胞。同步細胞群體在任何一時刻都處在細胞周期的同一相，彼此間形態、生化特征都很一致，因而是細胞學、生理學和生物化學等研究的良好材料。一、微生物的個體生長和同步生長23第七章微生物的生長與控制二、微生物的群體生長☆無分支單細胞微生物主要包括細菌和酵母菌，其群體生長是以群體中細胞數量的增加來表示的，☆由一個細胞分裂成為兩個細胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細胞數目擴大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間。☆右圖表示的是一個細胞經過若干代分裂后的情況。右圖可見，每經過一個代時，細胞數目就增加一倍，呈指數增加，因而被稱為指數生長，這就是單細胞群體生長的特征。1.無分支單細胞微生物的群體生長特征24第七章微生物的生長與控制★指數生長可以用下式表示：

b=B×2nB,b和t可由試驗獲得，n可通過上式計算得出，將等式兩側取對數重排后得：lgb=lgB+nlg2

式中：B

為起始細胞數目，

b

為指數生長某個時刻t時的細胞數目，

n

為世代數n==指數生長25第七章微生物的生長與控制例如：一培養液中微生物數目由開始的12，000（B），經4h（

t）后增加到49，000，000（b），這樣，n＝(lg4.9×107－lg1.2×104）÷0.301＝12★借助于n和t，還可以計算出不同培養條件下的代時G，

G＝t/n在本例中，G＝4×60/12＝20min∴該種微生物的代時為20分鐘。在4小時內共繁殖了12代。26第七章微生物的生長與控制2.無分支單細胞微生物的群體生長曲線☆以細菌為例介紹無分支單細胞微生物群體生長規律，其結論也基本適用于酵母菌。☆生長曲線代表了細菌在新的環境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態變化過程。☆每種細菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。27第七章微生物的生長與控制將少量單細胞的純培養，接種到一恒定容積的新鮮液體培養基中，在適宜條件下培養，每隔一定時間取樣，測菌細胞數目。以培養時間為橫坐標，以細菌增長數目的對數為縱坐標，繪制所得的曲線。生長曲線的制作28第七章微生物的生長與控制典型的生長曲線

（Growthcurve）延滯期對數期穩定期衰亡期時期的劃分：按照生長速率常數（growthraceconstant）不同29第七章微生物的生長與控制其它名稱：停滯期、調整期、適應期1.現象：活菌數沒增加，曲線平行于橫軸。2.特點：生長速率常數=0細胞形態變大或增長細胞內RNA特別是rRNA含量增高，原生質嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產生誘導酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學藥物）3.原因：適應新的環境條件，合成新的酶，積累必要的中間產物①.延滯期（lagphase）30第七章微生物的生長與控制◆菌種：繁殖速度較快的菌種的延遲期一般較短；◆接種物菌齡：用對數生長期的菌種接種時，其延遲期較短，甚至檢查不到延遲期；◆接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延遲期（發酵工業上一般采用1/10的接種量）；◆培養基成分：

在營養成分豐富的天然培養基上生長的延滯期比在合成培養基上生長時短；

接種后培養基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發酵工業上盡量使發酵培養基的成分與種子培養基接近。★影響延遲期長短的因素：31第七章微生物的生長與控制認識延遲期的特點及形成原因對實踐的指導意義：◆在發酵工業上需設法盡量縮短延遲期；采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優勢----適應性增強）②采用對數生長期的健壯菌種；③調整培養基的成分，在種子基中加入發酵培養基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業上，盡量在此期進行消毒或滅菌32第七章微生物的生長與控制②.對數期（logarithmicphase）其他名稱：指數期現象：細胞數目以幾何級數增加，其對數與時間呈直線關系。

特點：生長速率常數最大，即代時最短細胞進行平衡生長，菌體大小、形態、生理特征等比較一致代謝最旺盛細胞對理化因素較敏感影響因素：菌種營養成分營養物濃度﹡培養溫度33第七章微生物的生長與控制應用意義：①由于此時期的菌種比較健壯，生產上用作接種的最佳菌齡；②發酵工業上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度③食品工業上盡量使有害微生物不能進入此期④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態觀察等的良好材料。34第七章微生物的生長與控制營養物濃度與對數期生長速率和產量作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內，可影響生長速率和菌體產量的營養物就稱生長限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長速度和最大收獲量受影響時間細胞數或菌體量35第七章微生物的生長與控制③.穩定期（stationaryphase）又稱：恒定期或最高生長期特點：①新增殖的細胞數與老細胞的死亡數幾乎相等，微生物的生長速率處于動態平衡，培養物中的細胞數目達到最高值。②細胞分裂速度下降，開始積累內含物，產芽孢的細菌開始產芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產物，對于發酵生產來說，一般在穩定期的后期產物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。產生原因：

營養物尤其是生長限制因子的耗盡

有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）

物化條件不合適;36第七章微生物的生長與控制應用意義：1）發酵生產形成的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產上應盡量延長此期，提高產量，措施如下：補充營養物質（補料）

調pH

調整溫度

2）穩定期細胞數目及產物積累達到最高。生長產量常數（Y，或生長得率，growthyield）：概念：表示微生物對基質利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營養物質的濃度

根據產量常數可確定微生物對營養物質的需要量如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0

–C=x–x0C037第七章微生物的生長與控制④.衰亡期（declinephase）特點：①細胞死亡數增加，死亡數大大超過新增殖的細胞數，群體中的活菌數目急劇下降，出現“負生長”。②細胞內顆粒更明顯，細胞出現多形態、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產生的酶及代謝產物的作用，使菌體死亡、自溶等，發生自溶的菌生長曲線表現為向下跌落的趨勢。衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環境條件有關。產生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡38第七章微生物的生長與控制原理：當微生物在單批培養方式下生長達到對數期后期時，一方面以一定