第27講微生物的培養和分離

請回答下列有關大腸桿菌培養的問題：

Q)在大腸桿菌培養過程中，除考慮營養條件外，還要考慮、和滲透壓等條

件。由于該細菌具有體積小、結構簡單、變異類型容易選擇、、等優

點，因此常作為遺傳學研究的實驗材料。

(2)在微生物培養操作過程中，為防止雜菌污染,需對培養基和培養器皿進行(填“消

毒"或“滅菌”)；操作者的雙手需進行清洗和；靜止空氣中的細菌可用紫外線殺滅,

其原因是紫外線能使蛋白質變性，還能

____O

⑶若用稀釋涂布平板法計數大腸桿菌活菌的個數，要想使所得估計值更接近實際值，除應嚴

格操作、多次重復外，還應保證待測樣品稀釋的.

(4)通常,對獲得的純菌種還可以依據菌落的形狀、大小等特征對細菌進行初步

的O

(5)培養大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養基是否被污染。對于固體培養基應采用的檢測方

法是_________

____O

⑹若用大腸桿菌進行實驗,使用過的培養基及培養物必須經過處理后才能丟棄，以

防止培養物的擴散。

【解析】Q)大腸桿菌具有體積小、結構簡單、變異類型容易選擇、易培養、生活周期

短等優點，培養過程中，除考慮營養條件外，還要考慮溫度、酸堿度和滲透壓等條件。(2)滅菌是

用強烈的理化因素殺死物體內外所有的微生物,所以對培養基和培養皿進行滅菌;消毒是用較

為溫和的物理或化學方法僅殺死物體表面或內部一部分對人體有害的微生物方桑作者的雙手

需要進行清洗和消毒;紫外線能使蛋白質變性，還能損傷DNA的結構。（3）稀釋涂布平板法是

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養基的表面

進行培養，應保證樣品稀釋的比例適合。（4）對獲得的純菌種還可以依據菌落的形狀、大小等

特征對細菌進行初步的鑒定。（5）培養大腸桿菌時，在接種前需要檢測培養基是否被污染。對

于固體培養基應采用的檢測方法是將未接種的培養基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀察

培養基上是否有菌落產生。（6）因為有的大腸桿菌會釋放一種強烈的毒素，并可能導致人體腸

道出現嚴重癥狀,因此使用過的培養基及其培養物必須經過滅菌處理后才能丟棄，以防止培養

物的擴散。

【答案】Q）溫度酸堿度易培養生活周期短（2）滅菌消毒損傷DNA的結構

⑶比例合適（4）鑒定（或分類）（5）將未接種的培養基在適宜的溫度下放置適宜的時間，觀

察培養基上是否有菌落產生（6）滅菌

工業上常用酵母菌來改善釀造醬油的風味，在稀釋發酵階段，由于添加了較多的鹽才卬制了

大部分微生物的生長，而一些耐鹽酵母菌會繼續生長，發酵產生乙醇、有機酸等小分子物質,

增加醬油的風味。某實驗小組從傳統發酵醬油中篩選并分離耐鹽酵母菌，請回答下列問題：

⑴將酵母菌用于醬油發酵過程中，密封的發酵罐要留有一定的空間，其目的

是O

（2）若用牛肉膏蛋白陳培養基培養大腸桿菌很U培養基的pH需要調至。實驗室對

培養基滅菌的常見方法是。

（3）篩選耐鹽酵母菌的培養基中需要加入青霉素，其目的是.為了保證

篩選出的酵母菌具有耐鹽性，培養基中還需要加入o酵母菌發酵產生的乙醇

與（填試劑）反應會呈現灰綠色,該反應可用于乙醇的檢驗。

（4）在對菌液中的耐鹽酵母菌進行計數時，一般要將多個稀釋倍數的菌液分別涂布在平板上培

養，其目的是.

【解析】（1）將酵母菌用于醬油發酵過程中，密封的發酵罐要留有一定的空間，可以為酵母

菌提供氧氣，促進酵母菌的繁殖，使發酵后期有較多的酵母菌參與無氧呼吸。（2）大腸桿菌適宜

的培養基pH應為中性或微堿性。實驗室常用高壓蒸汽滅菌法進行培養基滅菌。（3）青霉素

可以抑制細菌的繁殖。篩選耐鹽的酵母菌，培養基中應加入一定濃度的食鹽溶液。酸化的重

鋁酸鉀溶液與乙醇反應會呈現灰綠色,可用于乙醇的檢驗。（4）在對菌液中的耐鹽酵母菌進行

計數時，需要從涂布平板中篩選菌落數在30~300的平板進行計數，所以要將多個稀釋倍數的

菌液分別涂布在平板上培養。

【答案】Q）為酵母菌提供氧氣,以促進酵母菌的繁殖（2）中性或微堿性高壓蒸汽滅菌

法（3）抑制細菌的繁殖一定濃度的食鹽溶液酸性重鋁酸鉀（4）保證能從中篩選出菌落

數在30-300的平板進行計數

多氯聯苯是一種對人體有很大危害的有機物質，呈油狀液體，污染土壤后很難清除。研究發

現部分酵母菌具有分解多氯聯苯的作用，為消除這種污染,科研人員計劃從受污染的土壤中篩

選出高效分解多氯聯苯的菌株。

Q）篩選分解多氯聯苯的菌株時，應將土壤樣品，接種到以為唯一碳源的培

養基上，從功能上講，該培養基屬于.

（2）對初步提取到的菌株要進行，一般操作方法有兩種，右圖表示法。

（3）將1mL酵母菌溶液稀釋100倍，在3個平板上用涂布法分別接入0.1mL稀釋液經適當

培養后,3個平板上的菌落數分別為56、57、58,據此可得出每升溶液中酵母菌活菌數

為O

【答案】⑴稀釋（溶解）多氯聯苯選擇培養基⑵純化平板劃線⑶5.7x107個

大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，是人和動物腸道中的正常棲居菌。自來水一旦被它污染，就有

可能引發腸道傳染病。因此，必須對自來水進行嚴格的檢測，以確保飲水安全。某同學欲檢測

家中自來水中大腸桿菌含量是否達標，對飲用水中的大腸桿菌進行了培養、計數和鑒定。回

答下列問題：

Q）實驗前應進行無菌處理,將漏斗、培養皿、三角瓶和銀子等進行滅菌,對培養

基進行滅菌，對自來水龍頭進行滅菌。

⑵為測定大腸桿菌的數目,將已知的水過濾后，將濾膜放在培養基上培養，注意

濾膜與培養基完全貼緊,不能有.

（3）為了鑒定大腸桿菌，在培養基中應加入.在該培養基上，大腸桿菌的菌落呈現

色。

【解析】Q）實驗室常用的消毒方法:煮沸消毒、化學藥物消毒、紫外線消毒。實驗室常

用的滅菌方法:灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌。微生物培養過程中要注意防止雜菌污

染，培養基常用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌，漏斗、培養皿、三角并酥口鏡子等進行干熱或高壓蒸

汽滅菌，而對自來水龍頭進行灼燒滅菌。（2）測定水體中大腸桿菌的數目時，過濾后的濾膜應與

培養基完全貼緊，不能有氣泡，如果有氣泡，則可能會被空氣中的微生物污染。（3）鑒定大腸桿菌

常用伊紅一美藍培養基，在該培養基上大腸桿菌的菌落呈現紫黑色。

【答案】（1）干熱（或高壓蒸汽）高壓蒸汽灼燒（2）體積氣泡（3）伊紅一美藍紫

黑

某罐裝泡菜制造廠希望通過改良現有的乳酸菌菌種提高泡菜中的乳酸含量。請回答相關問

題：

Q）微生物培養過程中，獲得純凈培養物的關鍵是.

（2）要改良現有的乳酸菌菌種的育種方式的原理是.菌種經過處理后，再接

種于經過處理的（填“固體”或“液體”）培養基中。

（3）已知“改良MC瓊脂培養基”中含有碳酸鈣，碳酸鈣遇酸溶解而使培養基變得透明；“孟

加拉紅瓊脂培養基"含氯霉素，可抑制絕大多數細菌的生長。對乳酸菌進行計數時應選擇上

述培養基，用法接種，挑選出具有透明圈的菌落進行計數。如

果每個平板均接種了0.1mL樣品并培養,接種的4個平板菌落數分別是210、230、470、

190,則樣品中菌種A的數量為個/mL。平板劃線法一般不用于活菌計數的原因

是O

【解析】本題考查微生物的培養與應用。微生物培養中的易混點有:1.無菌技術中對相

關的器皿、接種用具和培養基等用不同的滅菌方法2平板劃線法一般用于菌種的純化，可以

觀察菌落特征，對混合菌進行分離，稀釋涂布平板法一般用于篩選菌株，可以計數，可以觀察菌

落特征;3為保證結果準確，一般選擇菌落數在30~300的平板進行計數。⑴微生物培養中獲

得純凈培養物的關鍵是防止雜菌污染。（2）乳酸菌是原核生物，可通過誘導基因突變的方法改

良現有的乳酸菌菌種。由于乳酸菌在固體培養基上菌落較小，生長緩慢,所以用液體培養基擴

大培養接種前培養基應用高壓蒸汽滅菌法進行滅菌。（3）乳酸菌通過發酵能產生有機酸，所以

對乳酸菌進行計數時應選擇改良MC瓊脂培養基，用稀釋涂布平板法接種。平板菌落數為470

的與其他平板相差較大，應選擇平板菌落數分別是210、230、190的三個平板計算平均值。

樣品中菌種A的數量為210x10=2100個/mL;用平板劃線法接種得到的菌落多數不是單一

菌落,菌落數遠小于活菌數，所以平板劃線法一般不用于活菌計數。

【答案】Q）防止外來雜菌污染（2）基因突變高壓蒸汽滅菌液體（3）改良MC瓊脂

稀釋涂布平板2100得到的菌落多數不是單一菌落,菌落數遠小于活菌數

自然界中，除了植物和動物以外的生物統稱為微生物。微生物無處不在，大多數對我們人類

是有利的，少數有害。我們只有清楚地認識它們,才能合理利用它們。

（1）傳統發酵技術中，人們利用酵母菌制作果酒，利用醋酸菌制作醋，利用毛霉制作腐乳，以及利

用乳酸菌制作泡菜。

①可以依據是否將酵母菌、毛霉與醋酸菌、乳酸菌區分開。

②沒有經過嚴格的滅菌過程，卻能夠獲得傳統發酵產品，請說出兩點理曲

a.

b.。

（2）土壤有“微生物的天然培養基”之稱。

①現從紅色淤泥中篩選出一種生產胡蘿卜素的紅酵母菌株，純化并計數的接種方法

為。要大量繁殖該菌株應選用（填“液體”或“固

體”）培養基。

②若想在此菌株基礎上獲得多種其他未發現的新性狀菌株以供實驗需求，應該經過

處理，該育種方式的不足是具有一定的盲目性，需要大量處理供試材料。

【解析】Q）①酵母菌和毛霉是真菌,屬于真核生物，醋酸菌和乳酸菌是細菌，屬于原核生物,

因此，可以依據是否有以核膜為界限（包圍的）的細胞核將酵母菌、毛霉與醋酸菌、乳酸菌區分

開。②在發酵過程中,一方面，人為創造的環境有利于所培養的微生物生長，不利于其他微生物

生長，例如腐乳制作過程中加入的鹵湯中的香辛料具有防腐殺菌的作用，釀制果酒、制醋、制

作腐乳以及制作泡菜過程中均要嚴格控制相應的溫度、通氣情況等;另一方面,培養的微生物

發酵產物會抑制其他微生物生長，例如制作泡菜過程中乳酸菌發酵生成的乳酸,酵母菌發酵過

程中形成的缺氧、呈酸性的環境等都不利于其他微生物的生長。（2）①菌種計數最常用的接

種方法是稀釋涂布平板計數法;要大量繁殖該菌株應選用液體培養基。②若想在此菌株基礎

上獲得多種其他未發現的新性狀菌株以供實驗需求,應該經過誘變處理。

【答案】（1）①有以核膜為界限（包圍的）的細胞核②人為創造的環境有利于所培養的微

生物生長，不利于其他微生物生長培養的微生物所產生的發酵產物會抑制其他微生物生長

（2）①稀釋涂布平板法液體②誘變

在農業生產中發現一種廣泛使用的除草劑（含氮有機化合物）在土壤中不易降解，長期使用

可污染土壤。為修復被該除草劑污染的土壤,可按下面程序選育能降解該除草劑的細菌（已知

該除草劑在水中溶解度低，含一定量該除草劑的培養基不透明）。

長期使用

該除草劑

無透明

的土

薛取x圈菌落

種)有透明

上清液

7圈菌落

A.制備土壤B.培養基表面C.第2次及其后D.培養基培養

浸出液連續劃線劃線總從上次劃

線末端開始

Q)制備土壤浸出液時,為避免菌體濃度過高，需將浸出液進行處理。

(2)要在長期使用該除草劑的土壤中分離目的菌,從物理性質、用途方面來看，上述培養皿中培

養基的特點是

⑶在劃線培養時,培養基中只有很少菌落出現，大部分細菌在此培養基上不能生長的主要原

因是一

(4)在固體培養基上形成的菌落中，無透明圈菌落利用的氮源主要是，有透明圈菌

落利用的氮源主要是，據此可篩選出目的菌。

(5)科研人員用放射線處理該細菌獲得兩個突變株A和B,然后對突變株A和B進行實驗，結

果如下表所示：

接種的菌種一般培養基實驗處理及結果

A不生長添加營養物質甲,能生長

B不生長添加營養物質乙,能生長

A+B能生長不添加營養物質甲、乙就能生長

突變株A不能在一般培養基上生長的原因是.突變株A和B混合

在一起接種于一般培養基中能生長的最可能原因是

【解析】Q)制備土壤浸出液時，為避免菌體濃度過高,需將浸出液進行稀釋處理。(2)從物

理性質方面來看，題圖培養皿中培養基屬于固體培養基;從用途方面來看，該培養皿中培養基

屬于選擇培養基。該除草劑為含氮有機化合物，降解該除草劑的細菌可以除草劑為氮源，故該

培養基中除加入除草劑外，不再含有其他氮源，以選擇出能降解該除草劑的細菌。（3）在以該除

草劑為唯一氮源的培養基上，不能降解該除草劑的細菌（除具有固氮能力的細菌外）是不能生

長的。（4）含一定量該除草劑的培養基不透明，形成透明圈是由該除草劑被某些細菌降解引起

的。（5）突變株A的生長依賴于營養物質甲,突變株B的生長依賴于營養物質乙。不添加營養

物質甲和乙，二者混合培養時都能生長，最可能的原因是突變株A為突變株B提供了營養物質

乙,突變株B為突變株A提供了營養物質甲。

【答案】Q）稀釋（2）為無氮固體培養基，且需添加該除草劑作氮源（3）培養基中缺少這

些細菌可利用的氮源（4）氮氣該除草劑（5）突變株A缺乏合成營養物質甲所需要的酶

突變株A生長需要營養物質甲，突變株B可以提供;突變株B生長需要營養物質乙，突變株A

可以提供

我國糧食產區產生大量的作物秸稈，科技工作者為使其變廢為寶，研究出利用秸稈生產燃料

酒精的技術,為汽車用乙醇汽油提供來源，其大致流程如下（以玉米秸稈為例）：

|玉米利稈|預處理、水解木啊發醉

Q）玉米秸稈預處理后,應該選用特定的酶進行水解，使之轉化為發酵所需的葡萄糖。從以下哪

些微生物中可以提取到上述酶？.

A.釀制果醋的醋酸菌

B.生長在腐木上的霉菌

C.制作酸奶的乳酸菌

D.生產味精的谷氨酸棒狀桿菌

（2）若要從土壤中分離產生這種酶的微生物，所需要的培養基為（按功能分）,

培養基中的碳源為。對培養基進行滅菌，應該采用的方法

是0

⑶某同學對這種微生物培養液進行數量測定,在稀釋倍數為1。5對應的培養基中測得平板上

菌落數的平均值為23.4,那么每毫升樣品中的細菌數是（涂布平板

時所用稀釋液的體積為0.2mL）.

⑷用上述方法測定密度，實際活菌數量要比測得的菌落數量多，原因

是O

⑸上述流程圖中，發酵階段需要的菌種是，生產酒精要控制的必要條件

是O

【解析】本題主要考查纖維素分解菌的篩選，要求學生掌握實驗原理和方法，掌握微生物

培養過程中的滅菌方法，掌握釀酒的原理和方法，用植物秸稈生產酒精是利用微生物進行發酵

的過程。植物秸稈中的有機物主要是纖維素，纖維素分解菌產生的纖維素酶能將其水解成葡

萄糖。從土壤中分離纖維素分解菌的一般步驟是:土壤取樣、選擇培養、梯度稀釋、涂布培

養和篩選菌株。篩選纖維素分解菌必須使用以纖維素為唯一碳源的選擇培養基，并且需要對

纖維素酶分解纖維素后所產生的葡萄糖進行定量測定。Q）根據生物對環境適應性的原理，要

獲得能產生大量纖維素酶的菌種，應該從主要以纖維素為碳源的微生物中篩選,如生長在腐木

（主要成分為纖維素）上的、在反芻動物瘤胃中生存的很多微生物等均可能產生大量的纖維素

酶，故選B。（2）篩選目的微生物需要使用選擇培養基，培養基中的碳源為纖維素，培養基需要進

行高壓蒸汽滅菌。（3）每克（mL）樣品中的菌株數=（，k）x例其中C代表某一稀釋度下平板上

生長的平均菌落數,1/代表稀釋平板時所用的稀釋液的體積（mL）,例代表稀釋倍數。0=23.4

個,/=0.2mL,例=105,把上述數據代入公式可得稀釋前1mL菌液中所含細菌數

=（（r/k）x例=（23.4/0.2）x105=1.17x107個。（4）用稀釋涂布平板法進行微生物計數時，當兩

個或多個細胞連在一起時,平板上觀察到的是一個菌落，所以實際活菌數量要比測得的菌落數

量多。（5）上述流程圖中，發酵階段需要的菌種是酵母菌，酵母菌無氧呼吸可以產生酒精,因此生

產酒精要控制的必要條件是無氧（密封、密閉）。

【答案】⑴B（2）選擇培養基纖維素高壓蒸汽滅菌法（3）1.17x107（4）當兩個或

多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落（5）酵母菌無氧（密封、密閉）

自養需氧型的硝化細菌能夠降低水體中的鍍鹽,對水體有一定的凈化作用。請回答：

⑴培養硝化細菌時，將含有固體培養基的培養皿倒置的目的

是。培養基中加入被鹽為硝化細菌的生長提

供，培養基中沒有加入有機碳，從功能上看這種培養基屬于培養

基。

（2）硝化細菌純化并計數時，對照組應該涂布等量的。若實驗組每個平板中的菌落數

都超過了300,應對樣本菌液進行處理。

（3）實驗:探究弱酸、弱堿條件下硝化細菌對鍍鹽轉化能力的大小。取含核鹽的液體培養基均

分成等份，其pH可依次調節為，培養相同的時間后，可通過測定

培養基中的來判斷硝化細菌分解能力的大小。

【答案】Q）防止冷凝形成水滴污染培養基氮源（能量和氮源）選擇（2）無菌水適

當的稀釋（3）35、7、9（或6、7、8）（答案合理即可）鎮鹽的剩余量

阿拉伯膠是一種多糖，能被土壤中某些能合成阿拉伯膠降解酶的微生物分解，回答下列問

題。

（1）為從土壤中分離獲得能分解阿拉伯膠的單菌落,某同學設計了A、B、C、D四種培養基（成

分見下表）：

培養基ABCD

阿拉伯膠25g/L25g/L25g/L25g/L

——

Na