三七基因組分析及鐵皮石斛基因編輯體系的建立的開題報告一、研究背景及意義三七是傳統中藥材之一，其主要活性成分為三七皂苷。其具有調節血管張力、擴張冠狀動脈、抗炎、抗病毒、抗菌等功效，因此被廣泛應用于臨床。鐵皮石斛是另一種重要中藥材，其主要活性成分為多糖和皂苷。該藥材有明顯的免疫調節、抗氧化、抗炎及抗腫瘤等功效，因此在中藥領域應用廣泛。近年來，基因組學技術的快速發展為藥材研究帶來了全新的思路。通過基因組學研究可以識別重要基因、鑒定特異DNA序列、快速建立分類樹等。同時，基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術也為藥材研究提供了很好的平臺，可以精準、快速地改造藥材中的關鍵基因，進而提高藥材的活性成分含量和藥效。因此，本研究將利用基因組分析技術和CRISPR/Cas9基因編輯技術，分別對三七和鐵皮石斛的基因組進行分析和編輯，以期實現對這兩種藥材的重大基礎研究和應用開發。二、研究內容及方法1.三七基因組分析（1）對三七品種進行遺傳多樣性分析，并鑒定特異DNA序列。采用IlluminaHiSeq2500高通量測序技術，基于得到的數據進行遺傳多樣性分析，并結合序列比對和注釋方法，篩選出具有物種特異性、生物學功能和重要調控作用的DNA序列；（2）對重要基因進行鑒定和克隆。利用PCR擴增技術，獲取主要活性成分合成相關酶基因、信號轉導通路基因、轉錄因子基因等，建立基因序列庫；（3）應用CRISPR/Cas9基因編輯技術，對選定基因進行編輯，探究不同基因的編輯對活性成分含量的影響，以期找到調節三七藥效的關鍵基因。2.鐵皮石斛基因編輯體系的建立（1）尋找合適的體外培養方式，建立外植體再生體系；（2）設計并化學合成sgRNA，確定編輯靶點；（3）構建CRISPR/Cas9載體；（4）將構建好的CRISPR/Cas9載體轉化到外植體組織中；（5）篩選編輯成功的外植體組織，進行檢測，驗證編輯效果。三、研究預期成果1.三七基因組分析（1）確定三七品種遺傳多樣性情況，篩選出具有重要藥用功效的特異DNA序列；（2）鑒定與主要活性成分合成相關的基因，建立基因序列庫；（3）找到調節三七主要活性成分含量的關鍵基因，為探索三七藥理機制提供理論基礎。2.鐵皮石斛基因編輯體系的建立（1）建立鐵皮石斛外植體再生體系，為后續基因編輯提供外植體材料；（2）成功構建CRISPR/Cas9編輯系統，實現對鐵皮石斛重要基因的編輯；（3）驗證編輯效果，為后續鐵皮石斛藥效成分含量提高研究提供理論依據和實驗支持。四、進度安排本研究計劃分為兩年完成，預計進度安排如下：第一年：三七基因組分析1-6月：收集三七樣品，進行DNA提取和測序；7-12月：對測序數據進行分析，鑒定重要基因，建立基因序列庫。第二年：鐵皮石斛基因編輯體系的建立1-6月：建立鐵皮石斛外植體再生體系；7-12月：構建CRISPR/Cas9載體，并進行基因編輯，驗證編輯效果。五、預期貢獻本研究預期通過對三七和鐵皮石斛基因組的分析和編輯，找到調節藥效成分含量的關鍵基因和關鍵調控途徑，為進一步探究三七和鐵皮石斛藥理機制提供理論基礎。同時，通過鐵皮石斛基因編輯體系的建立，實現對鐵皮石斛重