關于蛋白質的結構和功能本章教學重點蛋白質元素組成特點，氨基酸結構通式，氨基酸分類、三字英文縮寫符號；肽、肽鍵的概念；蛋白質一、二、三、四級結構的概念及其穩定的主要化學鍵；二級結構主要形式及結構特點；蛋白質結構與功能的關系；變構效應的概念；蛋白質兩性電離，膠體性質，蛋白質變性概念和意義，紫外吸收和呈色反應；模體、結構域、分子伴侶的概念；鹽析、電泳和分子篩效應的原理。第2頁,共104頁，星期六，2024年，5月概述1.什么是蛋白質?蛋白質(protein)是由許多氨基酸(aminoacids)通過肽鍵(peptidebond)相連形成的高分子含氮化合物。第3頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質的生物學重要性2-1.蛋白質是生物體重要組成成分分布廣：所有器官、組織、細胞的各個部分都含有蛋白質。含量高：占人體干重的45％；脾、肺及橫紋肌等高達80％。第4頁,共104頁，星期六，2024年，5月1）作為生物催化劑（酶）2）代謝調節作用3）免疫保護作用4）物質的轉運和存儲5）運動與支持作用6）參與細胞間信息傳遞2-2.蛋白質具有重要的生物學功能2-3.氧化供能第5頁,共104頁，星期六，2024年，5月第1節蛋白質的分子組成Section1theMolecularComponentofProtein第6頁,共104頁，星期六，2024年，5月

蛋白質的元素組成

蛋白質元素組成的特點各種蛋白質的含氮量很接近且恒定，平均為16％。

通過測定生物樣品中的含氮量，再根據以下公式推算蛋白質的大致含量：主要有C、H、O、N和S。有些蛋白質含有少量磷或鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個別蛋白質還含有碘。100克樣品中蛋白質的含量(g%)=每克樣品含氮克數×6.25×1001/16%第7頁,共104頁，星期六，2024年，5月1.氨基酸氨基酸是組成蛋白質的基本單位。組成人體蛋白質的氨基酸僅有20種，且多屬L-氨基酸（僅甘氨酸除外）。L-glyceraldehyde(anL-sugar)L-serine(anL-AA)第8頁,共104頁，星期六，2024年，5月氨基酸的結構通式H甘氨酸CH3丙氨酸氨基酸的通式R第9頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1氨基酸的分類1）非極性脂肪族氨基酸2）極性中性氨基酸3）芳香族氨基酸4）酸性氨基酸5）堿性氨基酸*20種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下:｝第10頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1-1非極性脂肪族氨基酸(側鏈含烴鏈)第11頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1-2極性中性氨基酸(側鏈有極性但不帶電荷)第12頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1-3芳香族氨基酸(側鏈含芳香基團)第13頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1-4酸性氨基酸(側鏈含負性解離基團)第14頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-1-5堿性氨基酸(側鏈含正性解離基團)第15頁,共104頁，星期六，2024年，5月幾種特殊氨基酸脯氨酸（亞氨基酸）半胱氨酸(含巰基)

第16頁,共104頁，星期六，2024年，5月+胱氨酸二硫鍵-HH第17頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-2氨基酸的理化性質1-2-1.兩性解離及等電點等電點(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點。氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。第18頁,共104頁，星期六，2024年，5月pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性離子陽離子陰離子第19頁,共104頁，星期六，2024年，5月怎樣確定氨基酸pI酸堿滴定根據酸堿基團pKa計算中性氨基酸pI酸性氨基酸pI堿性氨基酸pI第20頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-2-2.紫外吸收芳香族氨基酸的紫外吸收Trp、Tyr(含共軛雙鍵)最大吸收峰在280nm附近。大多數蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。第21頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-2-3茚三酮反應氨基酸與茚三酮水合物共熱，大多可生成藍紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。由于此峰值與氨基酸的含量存在正比關系，可作為氨基酸定量分析方法。(氧化脫羧脫氨)第22頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.肽2-1肽(peptide)*肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。*肽鍵(peptidebond)是由一個氨基酸的

-羧基與另一個氨基酸的

-氨基脫水縮合而形成的化學鍵。第23頁,共104頁，星期六，2024年，5月+-HOH甘氨酰甘氨酸肽鍵第24頁,共104頁，星期六，2024年，5月*

兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽……*肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。*

由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。第25頁,共104頁，星期六，2024年，5月N末端：多肽鏈中有自由氨基的一端C末端：多肽鏈中有自由羧基的一端多肽鏈有兩端*多肽鏈(polypeptidechain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。第26頁,共104頁，星期六，2024年，5月N末端C末端牛核糖核酸酶第27頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2幾種重要的生物活性肽2-2-1.谷胱甘肽(glutathione,GSH)第28頁,共104頁，星期六，2024年，5月GSH過氧化物酶H2O22GSH2H2OGSSG

GSH還原酶NADPH+H+NADP+GSH與GSSG間的轉換第29頁,共104頁，星期六，2024年，5月

體內許多激素屬寡肽或多肽神經肽(neuropeptide)2-2-2.多肽類激素及神經肽第30頁,共104頁，星期六，2024年，5月第2節蛋白質的分子結構Section2theMolecularStructureofProtein第31頁,共104頁，星期六，2024年，5月蛋白質的分子結構包括

一級結構(primarystructure)二級結構(secondarystructure)三級結構(tertiarystructure)四級結構(quaternarystructure)高級結構第32頁,共104頁，星期六，2024年，5月1.蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構是指多肽鏈中氨基酸的排列順序。穩定蛋白質一級結構的主要化學鍵是肽鍵，有些蛋白質還包括二硫鍵。蛋白質一級結構是空間結構和功能的基礎，但不是唯一的因素。第33頁,共104頁，星期六，2024年，5月第34頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質的二級結構蛋白質的二級結構是指多肽鏈中某個肽段的主鏈骨架原子的相對空間位置。主鏈骨架原子包括N(H)，C(O)和相鄰的2個C

。穩定蛋白質二級結構的主要化學鍵是氫鍵。第35頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-1肽單元或肽單位(peptideunit)57°47°參與肽鍵的6個原子C

1、C、O、N、H、C

2位于同一平面，C

1和C

2在平面上所處的位置為反式(trans)構型，此同一平面上的6個原子構成了所謂的肽單元。第36頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2二級結構的主要形式

-螺旋(

-helix)

-折疊(

-pleatedsheet)

-轉角(

-turn)無規卷曲(randomcoil)

第37頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2-1

-螺旋肽段主鏈圍繞中心軸做有規律的螺旋式上升,螺旋走向為順時針(右手螺旋).肽單位(肽平面)圍繞N-Cα鍵旋轉57°(Phi角)或繞C-Cα鍵旋轉47°(Psi角).氨基酸側鏈伸向螺旋外側.每3.6個氨基酸殘基上升一圈(360°),螺距為0.54nm.每個肽鍵的N-H和第四個肽鍵的C=O形成與長軸平行的氫鍵.2Cα間距0.15nm。第38頁,共104頁，星期六，2024年，5月第39頁,共104頁，星期六，2024年，5月影響

-螺旋形成的因素氨基酸結構剛性(Pro)氨基酸形成離子鍵或靜電斥力

(Glu/Asp/His/Lys/Arg)氨基酸側鏈大小(Val/Ile)第40頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2-2

-折疊

伸展(2C

間的距離達0.35nm)

瘦長/彎曲/桶狀，兩鏈同向或反向在不同鏈或同一條鏈不同片段形成氫鍵側鏈突出在折疊的上方或下方強度大,有剛性第41頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2-3

-轉角和無規卷曲

-轉角無規卷曲是用來闡述沒有確定規律性的那部分肽鏈結構。

常由4個AA殘基組成

1stAA-C=O與4thAA-N-H形成氫鍵

2ndAA是Pro或Gly/Asp/Asn/Trp

形似發夾反向常見于反向平行末端第42頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-3超二級結構(模體/模序，motif)二級結構組合形式如：

，β

β，ββ。在許多蛋白質分子中，二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近所形成的有規則的二級結構組合，被稱為模體(motif)。模體是賦予功能含義的超二級結構。第43頁,共104頁，星期六，2024年，5月

第44頁,共104頁，星期六，2024年，5月鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鋅指結構第45頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-4側鏈對二級結構形成的影響蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成

-螺旋或β-折疊，它就會出現相應的二級結構。第46頁,共104頁，星期六，2024年，5月theconformationalpreferencesofthe20AAsforthe

-helixGlu、Met、Ala、LeuLys、Phe、Gln、Trp、Ile、ValAsp、HisCys、Ser、Thr、ArgAsn、TyrGly、ProStrongWeakWeak(usuallyfoundinthebeta-reverseturn)第47頁,共104頁，星期六，2024年，5月3.蛋白質的三級結構整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布。在二級結構基礎上進一步折疊形成天然結構/功能結構穩定因素：疏水鍵、離子鍵、氫鍵和VanderWaals力等。第48頁,共104頁，星期六，2024年，5月第49頁,共104頁，星期六，2024年，5月肌紅蛋白(Mb)三級結構N端

C端第50頁,共104頁，星期六，2024年，5月3-1結構域(domain)較大的蛋白質分子中折疊形成的

結構較為緊密的具獨特空間構象的并各行其功能的局部區域稱之纖連蛋白分子的結構域第51頁,共104頁，星期六，2024年，5月3-2分子伴侶(chaperon)*熱休克蛋白70(Hsp70)*伴侶蛋白(chaperonin)(如Hsp60/GroEL、GroES)*核質蛋白(nucleoplasmin)是為加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構提供合適微環境的一類蛋白質。第52頁,共104頁，星期六，2024年，5月*分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發生，使肽鏈正確折疊。*分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。*分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。第53頁,共104頁，星期六，2024年，5月第54頁,共104頁，星期六，2024年，5月4.蛋白質的四級結構蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質的四級結構。含有二條或多條多肽鏈的蛋白質分子中，每條具有完整三級結構的多肽鏈稱為蛋白質的亞基(subunit)。亞基間的結合力主要是疏水作用，其次是氫鍵和離子鍵。由2個亞基組成的蛋白質四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結構不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。第55頁,共104頁，星期六，2024年，5月血紅蛋白的四級結構第56頁,共104頁，星期六，2024年，5月5.蛋白質組學蛋白質組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質，即“一種基因組所表達的全套蛋白質”。蛋白質組學是研究細胞或機體全部蛋白質的表達及其活動方式(包括翻譯后修飾、轉運定位、結構變化、蛋白質間相互作用等)，揭示蛋白質功能與生命活動規律的一個新的研究領域。第57頁,共104頁，星期六，2024年，5月蛋白質組學是高通量，高效率的研究，其研究技術平臺：雙向電泳分離樣品蛋白質蛋白質點的定位、切取蛋白質點的質譜分析蛋白質組學研究的科學意義闡明生命在生理或病理狀態下的變化規律疾病診斷、新藥篩選、農業、環保等第58頁,共104頁，星期六，2024年，5月第3節蛋白質結構與功能的關系Section3TheRelationofStructure&FunctionofProtein第59頁,共104頁，星期六，2024年，5月1.蛋白質一級結構與功能的關系1-1一級結構是空間結構的基礎牛核糖核酸酶的一級結構二硫鍵第60頁,共104頁，星期六，2024年，5月天然狀態，有催化活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇非折疊狀態，無活性牛核糖核酸酶第61頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-2一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構和功能胰島素氨基酸殘基序號A5A6A10B30人ThrSerIleThr豬ThrSerIleAla狗ThrSerIleAla兔ThrGlyIleSer牛AlaGlyValAla羊AlaSerValAla馬ThrSerIleAla第62頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-3一級結構提供重要的生物進化信息細胞色素(cytochromeC)的進化樹第63頁,共104頁，星期六，2024年，5月表：細胞色素C的種屬差異量（以人CytC為參照）生物名稱黑猩猩恒河猴兔袋鼠鯨牛豬羊狗騾馬殘基差異數0191010

10

101112生物名稱雞、火雞響尾蛇烏龜狗、魚蛾小麥面包霉酵母殘基差異數1314153131354345同一種蛋白質一級結構差異愈小，物種間進化愈接近第64頁,共104頁，星期六，2024年，5月1-4一級結構改變可引起疾病例如：鐮刀形紅細胞貧血N-val·his·leu·thr·pro·glu

·glu·····C(146)HbSβ肽鏈HbAβ肽鏈N-val·his·leu·thr·pro·val·glu·····C(146)由蛋白質分子發生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。第65頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質空間結構與功能的關系2-1Hb亞基與Mb空間結構相似，都具有運輸氧氣的功能MbHbαHbβHbA第66頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-2Hb亞基構象變化可影響亞基與氧結合Hb與O2結合后稱為氧合Hb。氧合Hb占總Hb的百分數（稱百分飽和度）隨O2濃度變化而改變。O2saturationpO2(mmHg)P50P50Hb和Mb的氧結合/解離曲線S型矩型第67頁,共104頁，星期六，2024年，5月變構效應(allostericeffect)又稱別構效應。是指寡聚體蛋白質與其配體結合后，引起該蛋白質分子的構象變化，而導致其活性改變的現象。第68頁,共104頁，星期六，2024年，5月*協同效應(cooperativity)寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中其他亞基與配體結合能力的現象，稱之。如果是促進作用則稱為正協同效應

(positivecooperativity)如果是抑制作用則稱為負協同效應

(negativecooperativity)第69頁,共104頁，星期六，2024年，5月Deoxy-HbOxy-Hb第70頁,共104頁，星期六，2024年，5月O2血紅素與氧結合后，鐵原子半徑變小，就能進入卟啉環的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動。第71頁,共104頁，星期六，2024年，5月2-3蛋白質構象改變與疾病

若蛋白質的折疊發生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發生。這類疾病如：人紋狀體脊髓變性病、腦退行性疾病、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現為蛋白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。第72頁,共104頁，星期六，2024年，5月PrPcα-螺旋PrPscβ-折疊正常瘋牛病第73頁,共104頁，星期六，2024年，5月第4節蛋白質的理化性質Section4ThePhysical&ChemicalCharactersofProtein第74頁,共104頁，星期六，2024年，5月1.蛋白質的兩性解離蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液pH條件下可解離成帶負電荷或正電荷的基團。

當蛋白質溶液處于某一pH時，蛋白質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質的等電點(isoelectricpoint,pI)

。第75頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.蛋白質的膠體性質蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自1萬至數百萬kD，其分子的直徑可達1～100nm，為膠粒范圍之內。

穩定蛋白質膠體的因素：顆粒表面電荷、水化膜。第76頁,共104頁，星期六，2024年，5月+++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質在等電點的蛋白質水化膜++++++++帶正電荷的蛋白質－－－－－－－－帶負電荷的蛋白質不穩定的蛋白質顆粒酸堿酸堿酸堿脫水作用脫水作用脫水作用溶液中蛋白質的聚沉第77頁,共104頁，星期六，2024年，5月3.蛋白質的變性、凝固和沉淀蛋白質的變性(denaturation)是在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。

變性蛋白質的特征：（二硫鍵、非共價鍵破壞，溶解度降低，

黏度增加，不易結晶，易沉淀，易被蛋白酶水解，生物學活性喪失）第78頁,共104頁，星期六，2024年，5月造成變性的因素如加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等。

變性的本質——破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。第79頁,共104頁，星期六，2024年，5月應用舉例臨床醫學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。此外,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的必要條件。

第80頁,共104頁，星期六，2024年，5月若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為復性(renaturation)

。天然狀態，有催化活性非折疊狀態，無活性尿素、β-巰基乙醇去除尿素、β-巰基乙醇第81頁,共104頁，星期六，2024年，5月*蛋白質沉淀在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融合相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發生沉淀，但并不變性。*蛋白質的凝固作用(proteincoagulation)蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。

第82頁,共104頁，星期六，2024年，5月4.蛋白質的紫外吸收由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長處有特征性吸收峰。蛋白質的OD280與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。第83頁,共104頁，星期六，2024年，5月5.蛋白質的呈色反應⒈茚三酮反應(ninhydrinreaction)

蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發生茚三酮反應。⒉雙縮脲反應(biuretreaction)

蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現紫色或紅色，此反應稱為雙縮脲反應，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。第84頁,共104頁，星期六，2024年，5月△第85頁,共104頁，星期六，2024年，5月Peptidesandproteins(long-chainpolypeptides)reactwithCu2+inalkalinitytocreateablueviolet/redcolor.Thepeptidemusthaveatleast2peptidebonds.So,aminoacids…第86頁,共104頁，星期六，2024年，5月第5節蛋白質的分離純化與結構分析Section5Separation,Purification&AnalysisofProtein（自學）第87頁,共104頁，星期六，2024年，5月1.透析及超濾*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法。*超濾法

應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。第88頁,共104頁，星期六，2024年，5月2.丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀

*使用丙酮沉淀時，必須在0～4℃低溫下進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。*鹽析(saltprecipitation)是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。第89頁,共104頁，星期六，2024年，5月*免疫沉淀法：將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。第90頁,共104頁，星期六，2024年，5月3.電泳

蛋白質在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術,稱為電泳(elctrophoresis)。根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。第91頁,共104頁，星期六，2024年，5月幾種重要的蛋白質電泳*SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于蛋白質分子量的測定。*等電聚焦電泳，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。*雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究的重要技術。第92頁,共104頁，星期六，2024年，5月4.層析

層析(chromatography)分離蛋白質的原理待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固