關于菌落總數與大腸菌群數測定主要內容菌落總數測定大腸菌群測定MPN法原理（拓展內容）第2頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定掌握菌落總數測定方法實驗原理 不同稀釋度的樣品，營養瓊脂培養基，36℃，48h（水產品30℃，72h），菌落數第3頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定器材與試劑：樣品，無菌生理鹽水，平板計數瓊脂培養基，1ml吸管，培養皿第4頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定第5頁,共43頁，星期六，2024年，5月傾注培養第6頁,共43頁，星期六，2024年，5月培養結果第7頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定實驗步驟

5.菌落計數：肉眼觀察，可用放大鏡，可標記必要時分區計數，菌落成片者作廢計算方法某稀釋度的菌落數：兩平板菌落數取平均值選擇菌落數在30-300之間的稀釋度（1）僅有一個稀釋度在此范圍：菌落數×稀釋倍數第8頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定計算方法：（2）有兩個稀釋度在30-300之間菌落數之比>2，選較小值菌落數之比<2，取平均值（3）所有稀釋度均>300

取稀釋倍數最大者（4）所有稀釋度均<30

取稀釋倍數最小者（5）沒有任何稀釋度在30-300之間選最接近該范圍者結果單位：CFU/ml（g）第9頁,共43頁，星期六，2024年，5月菌落總數測定注意事項：

1.無菌操作

2.標記

3.何時更換吸管

4.吸吹混勻

5.瓊脂培養基保溫

6.安全常識第10頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定實驗目的實驗原理

36℃，48h，產氣（小倒管）三步法：初發酵、復發酵器材與試劑樣品、無菌生理鹽水、LST肉湯，BGLB肉湯

1ml吸管、10ml吸管、試管、小倒管第11頁,共43頁，星期六，2024年，5月初發酵器材與試劑樣品、225ml無菌生理鹽水、9ml無菌生理鹽水、雙料LST肉湯，單料LST肉湯，10ml吸管、1ml吸管、吸球第12頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定實驗步驟：

1.初發酵

第13頁,共43頁，星期六，2024年，5月第14頁,共43頁，星期六，2024年，5月第15頁,共43頁，星期六，2024年，5月吸取樣品方法第16頁,共43頁，星期六，2024年，5月加注樣品第17頁,共43頁，星期六，2024年，5月初發酵結果右邊為陽性結果，小倒管內有氣體產生。第18頁,共43頁，星期六，2024年，5月實驗步驟

3.復發酵（1）選取產氣試管（2）接種至10mlBGLB肉湯中（3）培養：36℃，48h

（4）觀察指標：若產氣則報告大腸菌群陽性。第19頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定實驗步驟

2.分離培養（1）制備伊紅美藍平板：

45℃，無菌，傾注，15ml

（2）選產酸產氣的發酵管（3）接種至伊紅美藍平板分區劃線法（4）培養：36℃，48h第20頁,共43頁，星期六，2024年，5月分離培養器材與試劑初發酵結果（4只發酵管）、酒精燈、接種環、伊紅美蘭平板培養基第21頁,共43頁，星期六，2024年，5月分區劃線法第一區劃線滅菌接種環第二區劃線滅菌接種環第三區劃線滅菌接種環第22頁,共43頁，星期六，2024年，5月分區劃線法操作要點

1.劃下一個區前必須滅菌接種環

2.劃線時接種環同平板呈30-40°角

3.每次劃線應該壓到上一個區域的2-3條線

4.用接種環的“面”而不是“弧”在平板上滑動第23頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定實驗步驟

2.分離培養：

（5）菌落特征：深紫黑色、有金屬光澤紫黑色、無或略有金屬光澤淡紫紅色、中心顏色深（6）革蘭染色、鏡檢：選特征菌落第24頁,共43頁，星期六，2024年，5月革蘭染色法器材與試劑結晶紫、盧戈碘液、95%乙醇、酸性復紅、生理鹽水、酒精燈、載玻片、濾紙第25頁,共43頁，星期六，2024年，5月革蘭染色法涂片：接種環，挑取菌落，生理鹽水一滴，涂勻熱固定：通過火焰若干次初染：結晶紫一滴，1min，水洗媒染：盧戈碘液一滴，1min，水洗脫色：95%乙醇，30s或至無色為止復染：復紅一滴，30s第26頁,共43頁，星期六，2024年，5月涂片第27頁,共43頁，星期六，2024年，5月熱固定第28頁,共43頁，星期六，2024年，5月初染第29頁,共43頁，星期六，2024年，5月媒染第30頁,共43頁，星期六，2024年，5月脫色第31頁,共43頁，星期六，2024年，5月復染第32頁,共43頁，星期六，2024年，5月革蘭氏染色陰性革蘭氏染色陽性革蘭染色法第33頁,共43頁，星期六，2024年，5月復發酵器材與試劑培養24小時后的伊紅美蘭平板、酒精燈、接種環、復發酵管第34頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定實驗步驟

3.復發酵（1）選取鑒定為無芽孢G-桿菌的菌落1-3個（2）接種至10ml乳糖蛋白胨培養液（3）培養：37℃，24h

（4）觀察指標：產酸，產氣第35頁,共43頁，星期六，2024年，5月液體接種第36頁,共43頁，星期六，2024年，5月復發酵復發酵陽性結果，培養基變成黃色，小倒管內有氣體產生第37頁,共43頁，星期六，2024年，5月大腸菌群數測定注意事項：

1.無菌操作

2.吸管使用

3.洗去染液的方法

4.顯微鏡保養

5.液體接種第38頁,共43頁，星期六，2024年，5月MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）目的：對某種細菌進行選擇性計數核心思想：泊松分布實施方法：多次稀釋直至無菌，每個稀釋度分別接種若干培養管，根據陽性管數估算MPN值第39頁,共43頁，星期六，2024年，5月MPN法原理MPN法（MostProbableNumberMethod）1.細菌進入發酵管的概率近似服從泊松分布:P(x=k)=e-x×xk/k!x:細菌濃度，k:進入發酵管的細菌數2.若在n管發酵中，令接種水樣量為Vi，陽性管數為Pi，陰性管數為Qi，則該檢驗結果發生的概率為：

其中C為常系數

V為總水樣量，x為細菌個數第40頁,共43頁，星期六，2024年，5月MPN法原理3.當y(x)max，XMPN4.由于y(x)為單極值函數，