1GB/T21101—202X飼料中豬源性成分的定性檢測實時熒光PCR法本文件規定了豬源性成分的實時熒光PCR檢測方法。本文件適用于飼料（包括飼料原料、配合飼料、濃縮飼料、精料補充料）中豬（Susscrofa)）源性成分的實時熒光PCR定性檢測。也適用于動物組織及加工品中豬（Susscrofa)）源性成分的實時熒光PCR定性檢測。本文件相對檢測下限為0.1%（W/W)，絕對檢測下限為5拷貝DNA/PCR反應。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法GB/T19495.3轉基因產品檢測核酸提取純化方法GB/T20195動物飼料試樣的制備3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1實時熒光PCRreal-timePCR在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號的積累實時監控整個PCR擴增過程3.2Ct值cyclethreshold每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）bp：堿基對（basepair）PCR：聚合酶鏈式反應（polymerasechainreaction）Tris：三羥甲基氨基甲烷（trihydroxymethylaminomethane）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）5原理2GB/T21101—202X根據豬β-actin基因的特異性序列設計引物和探針，采用實時熒光PCR技術進行擴增，根據擴增反應中產生的熒光信號和Ct值實現對豬源性成分的定性檢測。6試劑和材料除另有規定外，所有試劑均為分析純或生化試劑。實驗用水符合GB/T6682的要求。所有試劑均使用無DNA酶污染的容器存儲或分裝。6.1實時熒光PCR試劑（2×實時熒光PCR預混液)。6.2溶液配置用水：應符合GB/T6682二級水的要求。。6.3實時熒光PCR用超純水：不含DNA酶和RNA酶。6.41mol/LTris-HCl溶液（pH8.0稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用鹽酸調pH至8.0，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C條件下滅菌20min。6.50.5mol/LEDTA溶液(pH8.0)：稱取186.1gNa2EDTA·2H2O溶解于800mL水中，磁力攪拌器121°C條件下滅菌20min，室溫保存。6.6TE緩沖液（pH8.0）：分別量取10mLTris-HCl溶液和2mLEDTA溶液，加水定容至1000mL。在103.4kPa、121°C條件下滅菌20min。6.7引物和探針：用TE緩沖液將每條引物或者探針分別配制成100μmol/L儲存液備用，置-20℃以下凍存，避免多次凍融。序列見表1。表1引物探針序列5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGG5’-CCAGACTTGCCCTCCAATGG5’-[FAM]-CCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCG-[TAMRA]-3’豬5′-CGTAGGTGCACAGTAGPorcine-97bp-R5′-[FAM]-CCAGGTCGGGGAGTC-[7儀器設備7.1密閉的樣品粉碎儀或研磨機：碾磨細度達到60目，粉碎容器和刀具易于清洗。7.2離心機：離心速度≥14,000rpm。7.3紫外分光光度計或微量核酸蛋白測定儀。7.4實時熒光PCR儀。7.5電子天平：感量：0.1g。7.6微量移液器：2、10、100、200、1000μL等各種規格。8樣品按照GB/T20195規定制備試樣，至少200g，使用樣品粉碎儀或研磨機粉碎成粉狀，混合均勻，裝入密閉容器中，備用。在粉碎或碾磨一個樣品后，要將粉碎儀或研磨機的容器和刀具清洗干凈，防止污染下一個樣品。3GB/T21101—202X9檢測步驟9.1核酸提取按照GB/T19495.3的方法提取。提取出的核酸如需保存，須置于≤-20℃冰箱中。稱取粉碎后的樣品0.2~0.3g，按照GB/T19495.3附錄C.6.2中CTAB-2方法或其他合適的方法提取核酸。每個樣品設置兩個提取重復，并且設置一個提取空白對照。也可采用經驗證可靠的商業化DNA提取純化方法或試劑盒進行核酸提取純化，具體參照說明書使9.2DNA濃度和純度的測定吸取DNA提取液1μL，以超純水作為空白對照，使用分光光度計或微量核酸蛋白測定儀測定DNA模板的質量濃度。將提取的DNA溶液用于實時熒光PCR檢測。將提取的DNA模板的質量濃度稀釋到20ng/μL，用于實時熒光PCR檢測。9.3實時熒光PCR9.3.1對照和樣品檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照、空白對照。含有已知豬源成分的DNA樣品或含目標片段的質粒作陽性對照，用已知不含有目標物種成分的樣品（植物核酸樣品）作陰性對照，用等體積的超純水代替模板作為空白對照。由于核酸提取時，已經設置了兩個重復，在進行實時熒光PCR檢測時，對于每個DNA樣品，不再設置重復，只進行單次實時熒光PCR檢測。9.3.2反應體系按照表2配置50μL反應體系。表2實時熒光PCR實驗反應體系—注：最終反應體系中試劑添加的種類和總體系體積可能會根據不同的實時熒光PCR試劑產生差異。進行不同體系配置時，需要參照不同試劑使用說明書，并且需要保證表2中所列引物、探9.3.3反應程序按照表3的程序在實時熒光PCR儀上進行實時熒光PCR擴增。表3實時熒光PCR反應程序4GB/T21101—202X1注：根據不同實時熒光PCR試劑的要求，可以對反應程序中循環（擴增）步驟進行相應等效修改。10質量控制10.1內參對照基因擴增的質量控制當進行真核生物內參對照基因18SrRNA基因檢測時，符合下列條件，說明樣品提出了DNA，適合進行目標動物成分的實時熒光PCR檢測。a)提取空白對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≥37.0b)實時熒光PCR空白對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≥37.0。c)陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出，Ct值≤28.0。d)陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct值≤28.0。e)待測樣品：熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，Ct值≤33.0。10.2目標動物物種特異基因擴增的質量控制當進行目標動物物種特異基因的實時熒光PCR檢測時，以下條件有一條不滿足時，實驗視為無效，需重新進行檢測。a)提取空白對照：熒光通道無熒光信號檢出。b)實時熒光PCR空白對照：熒光通道無熒光信號檢出。c)陰性對照：熒光通道無熒光信號檢出。d)陽性對照：熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線。11結果判定和表述11.1結果判定在符合第10章的情況下，對樣品的檢測結果按以下進行判定：a)陽性結果的判定如果熒光通道有熒光信號檢出，且出現典型的擴增曲線，并且同一樣品的兩個實時熒光PCR檢測結果一致，則判定被檢樣品為陽性。b)陰性結果的判定如果熒光通道無熒光信號檢出，并且同一樣品的兩個實時熒光PCR檢測結果一致，則判定為被檢樣品陰性。c)痕量樣品結果的判定5GB/T21101—202X對于同一個樣品的兩個實時熒光PCR結果，一個為陽性，另一個為陰性時，應重新提取DNA（設置兩個重復并對每個DNA樣品，進行單次實時熒光PCR檢測。如果兩個實時熒光PCR復測結果均為陽性時，該樣品判定為陽性；如果兩個實時熒光PCR復測結果一個為陰性、另一個為陽性時，該樣品判定為陰性；如果兩個實時熒光PCR結果均為陰性結果時，該樣品判定為檢測限以下為陰性。11.2結果表述11.2.1結果為陽性的表述為“檢出豬源性DNA成分”。11.2.2結果為陰性的表述為“未檢出豬源性DNA成分”。12實驗污染防治措施按照GB/T27403中附錄D的規定執行。6GB/T21101—202X豬源性物種檢測靶基因參考序列18SrRNA：5’-AGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCACTCCCGACCCGGGGAGGTAGTGACGAAAAATAACAATACAGGACTCTTTCGAGGCCCTGTAATTGGAATGAGTCCACTTTA