ICS07.080微生物超低頻突變測定雙重測序法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T38481—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。1GB/T38481—2020微生物超低頻突變測定雙重測序法本標準規(guī)定了用雙重測序法測定微生物超低頻突變的方法。本標準適用于微生物基因組或基因片段超低頻突變的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3.1化學、物理或生物因素導致微生物DNA發(fā)生的頻率低于1×10-?的永久性改變。3.2條形碼標簽barcodelabel接在待測DNA片段兩側的核苷酸片段，用以標示同一擴增家族的DNA,協(xié)助進行突變位點的確認。3.3所有含兩端互補條形碼標簽的DNA片段。3.44原理在待測DNA片段兩端接上一段12nt隨機且互補的雙鏈核苷酸條形碼標簽，然后對所有帶有條形碼標簽的序列進行雙重的高通量測序。利用12nt隨機互補標簽，排除掉測序文庫制備過程中所引入5試劑5.2接頭鏈標簽序列：2a)5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3';N為A、T、C或G,由12個隨機堿基組成標簽片段。將寡核苷酸溶解于Tris-EDTA緩沖液(5.8)或純水中至終濃度100μmol/L,并放置于-20℃a)5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3';b)5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3'。X為按樣品需求設計的文庫標記序列。將寡核苷酸溶解于Tris-EDTA緩沖液(5.8)或純水中至終濃度20pμmol/L,并放置于-20℃保存。6儀器設備及器具7.1DNA提取利用微生物基因組或質(zhì)粒提取試劑盒對待測樣本進行基因組或質(zhì)粒DNA提取操作，最后使用利用高通量基因測序建庫試劑盒，將待測樣品DNA片段化至100bp～1000bp,將末端修復為A尾。8接頭條形碼標簽的合成將濃度100μmol/L的兩個接頭鏈寡核苷酸片段各取100pL進行退火，在95℃下加熱5min后，8.2延伸將8.1中得到的產(chǎn)物按試劑說明與脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)和克列諾酶混合均勻，分裝至兩個0.2mL的PCR管中并在37℃下孵育1h。GB/T38481—2020使用無水乙醇沉淀DNA,并加入200μL純水溶解。8.4酶切用限制性內(nèi)切酶HpyCH4Ⅲ對DNA產(chǎn)物進行酶切。將混合物分裝至4個0.2mL的PCR管中，并在37℃孵育16h。8.5純化加入并均勻混合50μL的3mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2),最終體積為550μL。將混合溶液平分到1.5mL的具塞離心管內(nèi)，每管275μL,并加入625μL室溫的無水乙醇到各管中。充分混勻，并以大于10000r/min的轉速在4℃下離心30min。移除上清液后，加入1mL的75%(體積分數(shù))乙醇至各管中。充分混勻，并立即以大于10000r/min的轉速在4℃下離心30min。移除上清液后，在紙巾上倒置試管10min以干燥，接著正置5min。加入100μL的Tris-EDTA緩沖液至上一步驟產(chǎn)物中并混合均勻。將所有試管集在一起，最終體9接頭條形碼標簽與待測樣本DNA的連接和擴增將互補條形碼標簽與DNA片段化和末端修復產(chǎn)物按總濃度20:1混合后，利用T4DNA連接酶9.2分選利用DNA分選磁珠試劑盒分選得到的產(chǎn)物，獲得長度為200bp～900bp的DNA片段，并以DNA試劑盒定量DNA濃度。9.3PCR擴增以分選產(chǎn)物為模板，接頭鏈擴增引物序列為引物，按每20萬讀數(shù)數(shù)據(jù)量取1amolDNA樣量進行PCR擴增，擴增程序根據(jù)所選用高保真DNA聚合酶的要求設定。10高通量測序利用高通量測序試劑盒對擴增得到的PCR產(chǎn)物進行高通量測序，每個待測樣品測序堿基數(shù)量設置為大于或等于10Gb。對高通量測序數(shù)據(jù)進行清理，然后按下列程序進行數(shù)據(jù)分析：a)根據(jù)隨機標簽進行互補標簽分類，每一個家族需包含雙向互補序列。互補標簽家族大小分布在排除1之后，最大峰值分布應于6～12之間。b)雙鏈同源序列在同一位點識別出突變才視為真正的突變位點。GB/T38481—202012