7.基因工程應(yīng)用大腸桿菌基因工程酵母菌基因工程高等植物基因工程哺乳動物基因工程新版大腸桿菌基因工程第1頁細菌與基因工程密不可分。1973年，Boyer和Cohen首次完成外源基因在大腸桿菌中表示，在試驗室里實現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)移，為基因工程開啟了通向現(xiàn)實應(yīng)用大門。幾年后，第一個基因工程產(chǎn)品—利用構(gòu)建基因基因工程菌生產(chǎn)人胰島素取得成功，從此人類進入了生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)時代。細菌不但在基因重組技術(shù)誕生和技術(shù)進步中起到了舉足輕重作用，而且細菌遺傳改造也是基因工程中歷史最早、研究最廣泛、取得實際應(yīng)用結(jié)果最多領(lǐng)域。新版大腸桿菌基因工程第2頁7-1.大腸桿菌基因工程C大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建策略B外源基因在大腸桿菌中高效表示原理A大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征E利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素D基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對策新版大腸桿菌基因工程第3頁一、大腸桿菌作為表示外源基因受體菌特征大腸桿菌表示外源基因優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表示系統(tǒng)成熟完善繁殖快速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA同意為安全基因工程受體生物新版大腸桿菌基因工程第4頁大腸桿菌表示外源基因劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)復(fù)性功效缺乏對真核生物蛋白質(zhì)修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確異源蛋白細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多內(nèi)毒素新版大腸桿菌基因工程第5頁二、外源基因在大腸桿菌中高效表示原理開啟子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)粒拷貝數(shù)新版大腸桿菌基因工程第6頁（一）開啟子開啟子最正確距離探測目標基因EEA開啟子A酶切開Bal31酶解目標基因EE新版大腸桿菌基因工程第7頁開啟子篩選AprorigalKpKO1采取鳥槍法戰(zhàn)略，將適當大小DNA片段克隆到開啟子探針質(zhì)粒pKO1上；受體細胞染色體DNA上galE、galT與質(zhì)粒上匯報基因galk表示產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)。轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-大腸桿菌受體菌株含有外源開啟子活性重組克隆新版大腸桿菌基因工程第8頁開啟子構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PLPrecAPtrpPlacPtraAPtac開啟子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAAT新版大腸桿菌基因工程第9頁開啟子可控性P乳糖開啟子Plac可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘導(dǎo)乳糖異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，整個操縱子處于基底水平表示；基底水平轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物能夠使開啟子Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄大幅提升。新版大腸桿菌基因工程第10頁PlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，cAMP激活CAP，CAP結(jié)合開啟子控制區(qū)，進而促進Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。基底水平轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝使cAMP降低，也能阻遏Plac介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用乳糖開啟子均為抗葡萄糖代謝阻遏突變型，即PlacUV5。CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄PlacO乳糖開啟子Plac可控性：新版大腸桿菌基因工程第11頁色氨酸開啟子Ptrp可控性：除去色氨酸色氨酸開啟子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)；在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。基底水平轉(zhuǎn)錄在正常細菌培養(yǎng)體系中,除去色氨酸是困難，所以基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)目基因表示。色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄PtrpOtrp阻遏蛋白

（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄OtrpPtrp新版大腸桿菌基因工程第12頁l噬菌體開啟子PlL可控性：噬菌體開啟子PL受CI阻遏蛋白阻遏，極難直接誘導(dǎo)控制。在基因工程中常使用溫度敏感型cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋在42℃時失活脫落，PL便可介導(dǎo)目標基因表示.PtrpAcI857BPL目標基因阻遏作用BPLPtrpA表示色氨酸但在大型細菌培養(yǎng)罐中快速升溫非常困難，所以常使用一個雙質(zhì)粒控制系統(tǒng)，用色氨酸間接控制目標基因表示。新版大腸桿菌基因工程第13頁（二）終止子1.強化轉(zhuǎn)錄終止必要性外源基因在強開啟子控制下表示，輕易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近DNA序列，形成長短不一mRNA混合物；過長轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因表示。新版大腸桿菌基因工程第14頁假如外源基因下游緊接有載體上其它主要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標識基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒復(fù)制及其它生物功效，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需時間就對應(yīng)增加，外源基因本身轉(zhuǎn)錄效率下降；過長mRNA往往會產(chǎn)生大量無用蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂能量消耗；更為嚴重是，過長轉(zhuǎn)錄物往往不能形成理想二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物翻譯效率。新版大腸桿菌基因工程第15頁2.強終止子選擇與使用當前外源基因表示質(zhì)粒中慣用終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上Tf；pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs轉(zhuǎn)化子對于一些終止作用較弱終止子，通常能夠采取二聚體終止子串聯(lián)特殊結(jié)構(gòu)，以增強其轉(zhuǎn)錄終止作用；終止子也能夠象開啟子那樣，從細菌或噬菌體基因組DNA中克隆篩選。終止子序列新版大腸桿菌基因工程第16頁（三）核糖體結(jié)合位點

外源基因在大腸桿菌細胞中高效表示不但取決于轉(zhuǎn)錄開啟頻率，而且在很大程度上還與mRNA翻譯起始效率親密相關(guān)。大腸桿菌細胞中結(jié)構(gòu)不一樣mRNA分子含有不一樣翻譯效率，它們之間差異有時可高達數(shù)百倍。mRNA翻譯起始效率主要由其5‘端結(jié)構(gòu)序列所決定，稱為核糖體結(jié)合位點（RBS）新版大腸桿菌基因工程第17頁四個特征結(jié)構(gòu)要素：1.核糖體結(jié)合位點結(jié)構(gòu)Shine-Dalgarno（SD）序列：位于翻譯起始密碼子上游6-8個核苷酸序列5’UAAGGAGG3’，它經(jīng)過識別大腸桿菌核糖體小亞基中16SrRNA3’端區(qū)域3’AUUCCUCC5’并與之專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，從而開啟翻譯；翻譯起始密碼子：大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架起始位點,但有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子；SD序列與翻譯起始密碼子之間距離及堿基組成。基因編碼區(qū)5’端若干密碼子堿基序列。啟始密碼子后為GCAU或AAAA時，翻譯效率最高。

新版大腸桿菌基因工程第18頁2.核糖體結(jié)合位點對外源基因表示影響

SD序列影響：

普通來說，mRNA與核糖體結(jié)合程度越強，翻譯起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序列與16SrRNA堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為主要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會造成翻譯效率大幅度降低。新版大腸桿菌基因工程第19頁SD序列與起始密碼子之間序列影響：緊鄰AUG前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌b-半乳糖苷酶mRNA而言，在這個位置上最正確堿基組合是UAU或CUU，假如用UUC、UCA或AGG取代之，則酶表示水平低20倍。SD序列下游堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效率最高；而CCCC或GGGG翻譯效率則分別是最高值50%和25%。新版大腸桿菌基因工程第20頁SD序列與起始密碼子之間距離影響：SD序列與起始密碼子之間準確距離確保了mRNA在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG恰好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中P位，這是翻譯開啟前提條件。在很多情況下,SD序列位于AUG之前大約7個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會造成翻譯起始效率不一樣程度降低。新版大腸桿菌基因工程第21頁起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子影響：大腸桿菌中起始tRNA分子能夠同時識別AUG、GUG和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同,通常GUG為AUG50%而UUG只及AUG25%。除此之外，從AUG開始前幾個密碼子堿基序列也至關(guān)主要，最少這一序列不能與mRNA5’端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上準確定位；當前廣泛用于外源基因表示大腸桿菌表示型質(zhì)粒上，均含有與開啟子起源相同核糖體結(jié)合位點序列，序列和間隔是最佳。新版大腸桿菌基因工程第22頁(四)密碼子1.生物體對密碼子偏愛性

不一樣生物，甚至同種生物不一樣蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，含有一定偏愛性。新版大腸桿菌基因工程第23頁生物基因組中堿基含量：在富含AT生物（如單鏈DNA噬菌體fX174）基因組中,密碼子第三位上U和A出現(xiàn)頻率較高;而在GC豐富生物（如鏈霉菌）基因組中,第三位上含有G或C簡并密碼子占90%以上絕對優(yōu)勢。密碼子與反密碼子相互作用自由能：性中等強度規(guī)律細胞內(nèi)tRNA含量如GGG、CCC、GCG、GGC、AAA、UUU、AUA、UAU等使用少；如GUG、CAC、UCG、AGC、ACA、UGU、AUC、UUG等使用多；偏愛密碼子決定原因：新版大腸桿菌基因工程第24頁2.密碼子偏愛性對外源基因表示影響因為原核生物和真核生物基因組中密碼子使用頻率含有較大程大差異性，因另外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯一個主要原因是密碼子正確選擇。普通而言，有兩種策略能夠使外源基因上密碼子在大腸桿菌細胞中取得最正確表示：

外源基因全合成同時表示相關(guān)tRNA編碼基因新版大腸桿菌基因工程第25頁按照大腸桿菌密碼子偏愛性規(guī)律，設(shè)計更換外源基因中不宜對應(yīng)簡并密碼子，重組人胰島素、干擾素以及生長激素在大腸桿菌中高效表示均采取了這種方法。

外源基因全合成新版大腸桿菌基因工程第26頁對于那些含有不友好密碼子、種類單一、出現(xiàn)頻率較高、而本身分子量又較大外源基因而言，則選擇相關(guān)tRNA編碼基因同時克隆表示策略較為有利。同時表示相關(guān)tRNA編碼基因新版大腸桿菌基因工程第27頁為了提升人尿激酶原cDNA在大腸桿菌中高效表示，將大腸桿菌這兩個tRNA編碼基因克隆在另一個高效表示質(zhì)粒上。由此構(gòu)建大腸桿菌雙質(zhì)粒系統(tǒng)有效地解除了受體細胞對外源基因高效表示制約作用。比如，在人尿激酶原cDNA412個密碼子中，共含有22個精氨酸密碼子，其中7個AGG、2個AGA，而大腸桿菌受體細胞中tRNAAGG和tRNAAGA豐度較低。新版大腸桿菌基因工程第28頁（五）質(zhì)粒拷貝數(shù)1.質(zhì)粒拷貝數(shù)對細菌生長代謝影響當前試驗室里廣泛使用表示型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細胞中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒擴增過程通常發(fā)生在受體細胞對數(shù)生長久內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛階段。質(zhì)粒分子過分增殖以及其后目標基因高效表示勢必會影響受體細胞生長代謝，進而造成重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性以及目標基因宏觀表示水平下降。新版大腸桿菌基因工程第29頁2.質(zhì)粒擴增時序控制在28℃時，每個細胞質(zhì)粒拷貝數(shù)為60oripCP3PLMCSApr在42℃時，拷貝數(shù)快速增至300-600在此溫度下，受體細胞染色體上CI基因表示溫度敏感型阻遏蛋白失活。所以，用一個伎倆同時控制質(zhì)粒拷貝數(shù)和基因表示pCP3擁有一個溫度可誘導(dǎo)型復(fù)制子新版大腸桿菌基因工程第30頁三、大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建策略包涵體型異源蛋白表示分泌型異源蛋白表示融合型異源蛋白表示寡聚型異源蛋白表示整合型異源蛋白表示蛋白酶抗性或缺點型表示系統(tǒng)構(gòu)建新版大腸桿菌基因工程第31頁（一）包涵體型異源蛋白表示1.包涵體及其性質(zhì)包涵體(InclusionBodies，IB)：在一些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露水不溶性結(jié)構(gòu)。新版大腸桿菌基因工程第32頁富含蛋白質(zhì)包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特征和生物功效，從而集聚形成包涵體。由高效表示質(zhì)粒構(gòu)建大腸桿菌工程菌大量合成非天然性同源或異源蛋白質(zhì)，后者在普通情況下也以包涵體形式存在于細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少許DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。新版大腸桿菌基因工程第33頁2.以包涵體形式表示目標蛋白優(yōu)缺點包涵體表示形式優(yōu)點：包涵體水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成份，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接經(jīng)過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來。在形成包涵體之后，大腸桿菌蛋白酶降解作用基本上對異源重組蛋白穩(wěn)定性已構(gòu)不成威脅。能簡化外源基因表示產(chǎn)物分離操作

能在一定程度上保持表示產(chǎn)物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定新版大腸桿菌基因工程第34頁包涵體表示形式缺點：以包涵體形式表示重組蛋白喪失了原有生物活性，必須經(jīng)過有效變性復(fù)性操作，才能回收得到含有正確空間構(gòu)象（因而含有生物活性）目標蛋白，所以包涵體變復(fù)性操作效率對目標產(chǎn)物收率至關(guān)主要。然而，這也是一個技術(shù)難題,尤其當目標蛋白分子中Cys殘基數(shù)目較高時，體外復(fù)性蛋白質(zhì)成功率相當?shù)停胀ú怀?0%。新版大腸桿菌基因工程第35頁3.以包涵體形式表示目標蛋白操作假如未進行特殊設(shè)計(如分泌型表示或融合型表示),外源基因在大腸桿菌中表示蛋白量占細胞總蛋白量20%以上時，表示產(chǎn)物普通傾向于形成包涵體。所以，以包涵體形式表示目標基因操作關(guān)鍵就是選擇高表示載體。實際上，這種高表示率也是包涵體法長處所在。新版大腸桿菌基因工程第36頁4.包涵體變性與復(fù)性操作C

共價修飾蛋白質(zhì)1）蛋白質(zhì)變性復(fù)性動力學(xué)原理：C1C2CnCUI1InNX1X2XnXAgAgAgAgI

有效變復(fù)性過程中中間狀態(tài)X

脫離有效變復(fù)性過程而進入集聚中間狀態(tài)N

天然狀態(tài)蛋白質(zhì)U

變性狀態(tài)蛋白質(zhì)A集聚狀態(tài)蛋白質(zhì)在細菌細胞內(nèi)，集聚狀態(tài)和共價修飾蛋白質(zhì)不能進入復(fù)性過程，所以永遠成為無活性蛋白質(zhì)。包涵體中蛋白質(zhì)就屬于這兩種狀態(tài)，所以需要在體外進行人工變性（解除共價修飾和驅(qū)散集聚體）復(fù)性操作。新版大腸桿菌基因工程第37頁2）包涵體溶解與變性：包涵體溶解與變性主要任務(wù)是拆開錯配二硫鍵和次級鍵在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復(fù)性路徑中。能有效促進包涵體溶解變性試劑和條件包含：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸，廉價，但影響復(fù)性和純化促溶劑

鹽酸胍、尿素，前者昂貴，尿素廉價，但常被自發(fā)形成氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中氨基反應(yīng)混合溶劑

如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH

廉價，但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應(yīng)新版大腸桿菌基因工程第38頁5.包涵體復(fù)性與重折疊（refolding）：包涵體復(fù)性與重折疊主要任務(wù)是：將多肽鏈中被拆開游離巰基重新折疊經(jīng)過次級鍵形成使蛋白質(zhì)復(fù)性新版大腸桿菌基因工程第39頁包涵體復(fù)性與重折疊（refolding）：復(fù)性操作1)包涵體復(fù)性操作方法包含：一步稀釋法：蛋白復(fù)性與濃度無關(guān)，但集聚與濃度關(guān)系很大分段稀釋法：逐步降低變性劑濃度，預(yù)防二次集聚發(fā)生試劑添加法：精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修飾法：氨基檸檬酸酐酰化，蛋白帶負電，抑制集聚產(chǎn)物隔離法：將變性蛋白分子固定化，防止其相互碰撞分子伴侶法：GroEL、GroES、DnaK，固定化，共表示新版大腸桿菌基因工程第40頁包涵體復(fù)性與重折疊(refolding)：二硫鍵形成在包涵體變性體系中，一直存在著還原劑，使多肽鏈中巰基保持還原狀態(tài)，防止二硫鍵錯配造成嚴重集聚。在變性操作結(jié)束后，這些游離型巰基必須重新配對形成二硫鍵，此時多肽鏈也重新發(fā)生折疊。新版大腸桿菌基因工程第41頁化學(xué)氧化法（A）需要電子受體，最廉價電子受體為空氣，二硫鍵形成是隨機，僅適合用于那些不含游離半胱氨酸殘基蛋白質(zhì)重折疊。二硫鍵交換（B）需要還原型和氧化型谷胱甘肽（GSH和GSSG），二硫鍵形成相對特異，所以適用性較廣，重折疊效果好。形成二硫鍵方式主要有：HSHS

S

S2e+2H+AHSHS

S-S-R

HS+BR-S-S-R

SS2R-SH新版大腸桿菌基因工程第42頁（二）分泌型異源蛋白表示即以可溶性或不溶性（包涵體）狀態(tài)存在于細胞質(zhì)中；或者經(jīng)過運輸或分泌方式定位于細胞周質(zhì)，甚至穿過外膜進入培養(yǎng)基中。蛋白產(chǎn)物N端信號肽序列存在是蛋白質(zhì)分泌前提條件。在大腸桿菌中表示異源蛋白按其在細胞中定位可分為兩種形式：新版大腸桿菌基因工程第43頁1.以分泌形式表示目標蛋白優(yōu)缺點分泌表示形式優(yōu)點：目標蛋白穩(wěn)定性高

重組人胰島素原若分泌到細胞周中，其穩(wěn)定性大約是在細胞質(zhì)中10倍。目標蛋白易于分離目標蛋白末端完整

相當多真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸殘基。當這些真核基因在大腸桿菌中表示時，蛋白質(zhì)N端甲硫氨酸殘基往往不能被切除。如若將外源基因與大腸桿菌信號肽編碼序列重組在一起，一旦分泌型表示，其N端甲硫氨酸殘基便可在信號肽剪切過程中被有效除去。新版大腸桿菌基因工程第44頁分泌表示形式缺點：外源真核生物基因極難在大腸桿菌中進行分泌型表示，少數(shù)外源基因既便能分泌表示，但其表示率通常要比包涵體方式低很多；相對其它生物細胞而言，大腸桿菌蛋白分泌機制并不健全；所以當前用于產(chǎn)業(yè)化異源蛋白分泌型重組大腸桿菌盡管有，但并不普遍。新版大腸桿菌基因工程第45頁2.蛋白質(zhì)分泌機制所以與包涵體相比，分泌型重組蛋白含有較高百分比正確構(gòu)象，生物活性回收率增加，且對蛋白酶不敏感。信號肽胞內(nèi)胞外目標蛋白內(nèi)膜外膜周質(zhì)胞壁信號肽剪切酶系原核細菌周質(zhì)中含有各種分子伴侶可阻止分泌蛋白隨機折疊，分泌在細胞周質(zhì)或培養(yǎng)基中重組蛋白極少形成份子間二硫鍵交聯(lián)；新版大腸桿菌基因工程第46頁3.分泌型目標蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建包含大腸桿菌在內(nèi)絕大多數(shù)革蘭氏陰性菌不能將蛋白質(zhì)直接分泌到胞外，但有些革蘭氏陰性菌能將細菌抗菌蛋白（細菌素）分泌到培養(yǎng)基中；這一過程嚴格依賴于細菌素釋放蛋白，它激活定位于內(nèi)膜上磷酸酯酶，造成細菌內(nèi)外膜通透性增大。新版大腸桿菌基因工程第47頁所以，只要將細菌素釋放蛋白編碼基因克隆在一個適當質(zhì)粒上即可構(gòu)建完全分泌型受體細胞。此時，用另一個攜帶大腸桿菌信號肽編碼序列和目標基因表示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化上述完全分泌型受體細胞，并使用相同性質(zhì)開啟子介導(dǎo)目標基因轉(zhuǎn)錄，則可實現(xiàn)目標蛋白從重組大腸桿菌中完全分泌。新版大腸桿菌基因工程第48頁（三）融合型異源蛋白表示除了直接表示異源蛋白外，還可將外源基因與受體菌本身蛋白質(zhì)編碼基因拼接在一起，并作為一個開放型閱讀框架進行表示。由這種雜合基因表示出蛋白質(zhì)稱為融合蛋白。在這種融合蛋白結(jié)構(gòu)中，通常受體細菌蛋白部分位于N端，異源蛋白位于C端。經(jīng)過在DNA水平上人工設(shè)計引入蛋白酶切割位點或化學(xué)試劑特異性斷裂位點，能夠在體外從純化融合蛋白分子中釋放回收異源蛋白。新版大腸桿菌基因工程第49頁1.以融合形式表示目標蛋白優(yōu)缺點目標蛋白穩(wěn)定性高尤其對分子量較小多肽效果更佳目標蛋白易于分離利用受體蛋白成熟抗體、配體、底物進行親和層析，能夠快速取得純度較高融合蛋白目標蛋白表示率高與受體蛋白共用一套完善表示元件目標蛋白溶解性好因為受體蛋白存在，融合蛋白往往能在胞內(nèi)形成良好空間構(gòu)象，且大多含有水溶性目標蛋白需要回收融合蛋白需要裂解和深入分離，才能獲目標蛋白。在實際生產(chǎn)中，產(chǎn)品主要成本往往就在該工段新版大腸桿菌基因工程第50頁2.融合型目標蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建1）融合蛋白表示質(zhì)粒構(gòu)建標準：受體細胞結(jié)構(gòu)基因能高效表示，且其表示產(chǎn)物能夠經(jīng)過親和層析進行特異性簡單純化；外源基因應(yīng)裝在受體蛋白編碼基因下游，為融合蛋白提供終止密碼子。在一些情況下，并不需要完整受體結(jié)構(gòu)基因，目標是盡可能防止融合蛋白分子中兩種組份分子量過于靠近，為目標蛋白分離回收創(chuàng)造條件；兩個結(jié)構(gòu)基因拼接位點處序列設(shè)計十分主要，它直接決定著融合蛋白裂解工藝；兩個蛋白編碼序列應(yīng)保持一致翻譯閱讀框架。新版大腸桿菌基因工程第51頁2）用于融合蛋白構(gòu)建受體蛋白：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）

維持良好空間構(gòu)象麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP）

促進分泌硫氧化還原蛋白（TrxA）

維持良好空間構(gòu)象pTrxFus金黃色葡萄球菌蛋白A（SAPA）

免疫親和層析pRIT2Tβ-半乳糖苷酶（LacZ）

免疫親和層析外膜蛋白（OmpF）

促進分泌泛素蛋白（Ubi）

維持良好空間構(gòu)象新版大腸桿菌基因工程第52頁3)目標蛋白回收融合蛋白中受體蛋白部分存在可能會影響目標蛋白空間構(gòu)象和生物活性，假如將之注入人體還會造成免疫反應(yīng)，所以在制備和生產(chǎn)藥用目標蛋白時，將融合蛋白中受體蛋白部分完整除去是必不可少工序。酶促裂解法

化學(xué)斷裂法

融合蛋白位點專一性斷裂方法有兩種：新版大腸桿菌基因工程第53頁用于蛋白位點專一性化學(xué)斷裂最正確試劑為溴化氰（CNBr）它與多肽鏈中甲硫氨酸殘基側(cè)鏈硫醚基反應(yīng)，生成溴化亞氨內(nèi)酯，后者不穩(wěn)定，在水作用下肽鍵斷裂，形成兩個多肽降解片段；

化學(xué)斷裂法：其中上游肽段甲硫氨酸殘基轉(zhuǎn)化為高絲氨酸殘基，而下游肽段N端第一位氨基酸殘基保持不變。新版大腸桿菌基因工程第54頁這一方法優(yōu)點：然而，假如異源蛋白分子內(nèi)部含有甲硫氨酸殘基，則不能用此方法!回收率高（可到達85%以上），專一性強，產(chǎn)生目標蛋白N端不含甲硫氨酸，與真核生物細胞中成熟表示產(chǎn)物較為靠近。新版大腸桿菌基因工程第55頁酶促裂解法：單殘基位點蛋白酶酶促裂解法特點是斷裂效率更高，同時每種蛋白酶均含有對應(yīng)斷裂位點決定簇，所以可供選擇專一性斷裂位點范圍較廣。幾個斷裂位點專一性最強商品化蛋白酶分別在多肽鏈中精氨酸、谷氨酸、賴氨酸殘基處切開酰胺鍵，形成不含上述殘基下游斷裂肽段，與溴化氰化學(xué)斷裂法相同。新版大腸桿菌基因工程第56頁

用上述蛋白酶裂解融合蛋白前提條件：外源蛋白分子內(nèi)部不能含有精氨酸、谷氨酸或賴氨酸殘基，假如外源基因表示產(chǎn)物為小分子多肽，這一限制條件并不苛刻，但大分子量異源蛋白來說，上述三種氨基酸殘基出現(xiàn)頻率是相當高。新版大腸桿菌基因工程第57頁蛋白內(nèi)切酶切割位點梭菌蛋白酶葡萄球菌蛋白酶假單孢菌蛋白酶豬胰蛋白酶ArgCNNC受體蛋白目標蛋白Arg-CGlu-CLys-CArg-CLys-C新版大腸桿菌基因工程第58頁酶促裂解法：多殘基位點為了克服僅切單一氨基酸殘基蛋白酶所帶來應(yīng)用局限性，可在受體蛋白編碼序列與不含起始密碼子外源基因之間加裝一段編碼寡肽序列（Ile-Glu-Gly-Arg）人工接頭片段，該寡肽為含有蛋白酶活性凝血因子Xa識別和作用序列，其斷裂位點在ArgC末端。新版大腸桿菌基因工程第59頁因為Xa識別作用序列由四個氨基酸殘基組成，大多數(shù)蛋白質(zhì)中出現(xiàn)這種寡肽序列概率極少，所以這種方法可廣泛用于從融合蛋白中回收各種不一樣大小目標蛋白產(chǎn)物。純化后融合蛋白用Xa處理，即可取得不含上述寡肽序列目標蛋白。新版大腸桿菌基因工程第60頁酶促裂解法：多殘基位點開啟子受體基因接頭目標基因MetArgStopLysGluIle-Glu-gly-ArgGluArgLysIle-Glu-gly-Arg表示親和層析酶解回收新版大腸桿菌基因工程第61頁PinpointXatac生物素結(jié)合肽編碼序列Xa因子識別位點編碼序列SP6T7AproriMCSATCGAAGGTCGCGAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-1IleGluGlyArg

GluATCGAAGGTCGCGAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-2ATCGAAGGTCGCGAAAAGCTTCAGCTGGGATCCGGTACCGATATCAGATCTCCCGGGGCGGCCGCXa-3NruIHindIIIPvuIIBamHIKpnIEcoRVBglIISmaINotIXa因子切割位點酶促裂解法：多殘基位點新版大腸桿菌基因工程第62頁（四）寡聚型異源蛋白表示從理論上講，外源基因表示水平與受體細胞中可轉(zhuǎn)錄基因拷貝數(shù)（即基因劑量）呈正相關(guān)。然而重組質(zhì)粒除了含有外源基因外，還攜帶其它可轉(zhuǎn)錄基因，如作為篩選標識抗生素抗性基因等。伴隨重組質(zhì)粒拷貝數(shù)不停增加，受體細胞內(nèi)大部分能量和原料被用于合成全部重組質(zhì)粒編碼蛋白，而細胞正常生長代謝卻因能量不濟受到影響，所以經(jīng)過增加質(zhì)粒拷貝數(shù)提升外源基因表示產(chǎn)物產(chǎn)量往往不能取得滿意效果。新版大腸桿菌基因工程第63頁另一個經(jīng)過增加外源基因劑量而提升目標蛋白產(chǎn)量有效方法是構(gòu)建寡聚串聯(lián)型異源蛋白表示載體，即將多拷貝外源基因克隆在一個低拷貝質(zhì)粒上，以取代單拷貝外源基因在高拷貝載體上表示策略。新版大腸桿菌基因工程第64頁1.以寡聚形式表示目標蛋白優(yōu)缺點目標蛋白高效表示在不提升質(zhì)粒拷貝數(shù)前提下，增加目標基因拷貝數(shù)，能夠在一定程度上改進表示量；穩(wěn)定表示小分子短肽目標產(chǎn)物回收困難短肽因為缺乏有效空間結(jié)構(gòu)，在細菌細胞中半衰期較短。串聯(lián)短肽含有與蛋白質(zhì)相同長度及空間結(jié)構(gòu)，因而抗蛋白酶降解能力大幅度提升；寡聚短肽需要裂解和深入分離，才能獲最終分子，但裂解后短肽分子輕易出現(xiàn)序列不均一性。新版大腸桿菌基因工程第65頁2.寡聚型目標蛋白表示系統(tǒng)構(gòu)建PSDgenegenegenegeneT1T2H2NCOOHMetMetMetMetmRNACNBr基本戰(zhàn)略：新版大腸桿菌基因工程第66頁構(gòu)建舉例：PSDT1T2EcoRIBamHIAATTCAGATCTGTCTAGAGCCTAGEcoRIBgl

IIBamHIEcoRIBamHIBgl

IIGATCTAGCCTAGEcoRIBamHIBglIIEcoRIBamHIBglIIEcoRI

+BamHIBgl

II+

BamHIBamHI新版大腸桿菌基因工程第67頁(五)整合型異源蛋白表示1.以整合形式表示目標蛋白優(yōu)缺點目標基因穩(wěn)定表示整合型目標基因隨受體細胞染色體DNA復(fù)制而復(fù)制，在大多數(shù)情況下相當穩(wěn)定，工程菌在沒有選擇壓力存在下能夠連續(xù)培養(yǎng)而不丟失目標基因表示盒，這對以改良物種遺傳性狀為目標基因工程案例尤其有意義。目標基因表示率低單拷貝整合目標基因表示率受到限制，此時可經(jīng)過強化表示元件而加以賠償。新版大腸桿菌基因工程第68頁2.DNA體內(nèi)重組基本原理細胞內(nèi)遺傳重組可分為兩大類：

轉(zhuǎn)位因子依賴型同源序列依賴型在生物體細胞尤其是原核細菌細胞內(nèi)，廣泛存在著DNA遺傳重組機制，其可能生物學(xué)功效是促進生物種群進化。新版大腸桿菌基因工程第69頁

轉(zhuǎn)位因子是指生物細胞內(nèi)天然存在一類無復(fù)制能力DNA可移動因子，不一樣生物種群擁有結(jié)構(gòu)不一樣轉(zhuǎn)位因子，比如：

1）轉(zhuǎn)位因子依賴型體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子家族噬菌體 G片段（G-Fragment）原核細菌 插入次序（IS）真核細菌 轉(zhuǎn)座子（Tn、Ty）高等植物可移動因子（Ac、Ds）高等動物 跳躍基因（mobilgene）新版大腸桿菌基因工程第70頁IS（1kb）Ty（5

kb）Tn（2

-

20kb）ACCATGGTTTTGGTACCA抗藥性基因轉(zhuǎn)位酶基因識別位點阻遏基因IRIRIRIRISIS轉(zhuǎn)位因子依賴型體內(nèi)重組：轉(zhuǎn)位因子結(jié)構(gòu)新版大腸桿菌基因工程第71頁轉(zhuǎn)位因子依賴型體內(nèi)重組：整合形式新版大腸桿菌基因工程第72頁在很多原核細菌細胞中，染色體DNA鏈上兩個同源區(qū)之間可發(fā)生同源重組，其頻率與細菌種類、兩個同源區(qū)之間距離同源區(qū)長度、同源程度親密相關(guān)。2)同源序列依賴型體內(nèi)重組：基本形式普通地說，距離越遠、長度越長、同源性越高，重組頻率也就越高，反之亦然。同源重組有整合和交換兩種形式，前者只需要一個斷裂位點，而后者包括兩個斷裂位點。新版大腸桿菌基因工程第73頁同源序列依賴型體內(nèi)重組：同源整合ori目標基因同源區(qū)域標識基因整合位點染色體DNA新版大腸桿菌基因工程第74頁同源序列依賴型體內(nèi)重組：同源交換ori目標基因同源區(qū)域標識基因交換區(qū)域染色體DNAori標識基因+新版大腸桿菌基因工程第75頁（六）蛋白酶抗性或缺點型表示系統(tǒng)構(gòu)建不論是在真核生物還是在原核細胞中，重組目標蛋白表達后都見面臨被降解命運，其穩(wěn)定性甚至還不如半衰期較短受體細胞內(nèi)源性蛋白質(zhì)。在大多數(shù)情況下，重組目標蛋白不穩(wěn)定性可歸結(jié)為對受體細胞蛋白酶系統(tǒng)敏感性。然而越來越多試驗表明，重組目標蛋白在受體細胞內(nèi)半衰期能夠經(jīng)過蛋白序列人工設(shè)計以及受體細胞改造加以調(diào)整和控制。新版大腸桿菌基因工程第76頁試驗結(jié)果表明，大多數(shù)不穩(wěn)定重組目標蛋白是被大腸桿菌中蛋白酶La和Ti降解，二者分別由lon和clp基因編碼，其蛋白水解活性依賴于ATP。1.蛋白酶缺點型受體細胞改造1）lon基因缺點大腸桿菌受體(lon-)：lon基因由熱休克等環(huán)境壓力激活，細胞內(nèi)異常蛋白或重組異源蛋白過量表示也可作為一個環(huán)境壓力誘導(dǎo)lon基因表示。lon-大腸桿菌突變株可使原來半衰期較短細菌調(diào)控蛋白(如SulA、RscA、lN）穩(wěn)定性大增，所以被廣泛用作外源基因高效表示受體菌。新版大腸桿菌基因工程第77頁熱休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及環(huán)境壓力特異性s因子編碼基因htpR突變株均展現(xiàn)出對異源蛋白降解作用嚴重缺點；htpR基因缺點大腸桿菌受體（htpR-）：大腸桿菌中龐大熱休克蛋白家族對異常或異源蛋白降解也有主要作用，其機理是脅迫異常或異源蛋白形成一種對蛋白酶識別和降解較有利空間構(gòu)象，從而提升異常或異源蛋白對蛋白酶敏感性；尤其是lon-htpR-雙缺點株，非常適合高效表示各種不穩(wěn)定重組異源蛋白。新版大腸桿菌基因工程第78頁大量試驗結(jié)果表明，在所有極性氨基酸中，天冬氨酸（Asp）存在對提升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性效應(yīng)最顯著，而且Asp殘基離C末端越近，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性就越大。2.抗蛋白酶重組異源蛋白序列設(shè)計1)多肽鏈C末端氨基酸序列對穩(wěn)定性影響：更為主要是，在各種結(jié)構(gòu)和功效相互獨立蛋白質(zhì)C末端引入Asp殘基，都能顯著地延長這些蛋白質(zhì)半衰期，因此含有普遍意義。新版大腸桿菌基因工程第79頁大量試驗結(jié)果同時表明，假如多肽鏈N末端序列中含有較高百分比Ala、Asn、Cys、Gln、His，則蛋白質(zhì)穩(wěn)定性顯著改進。2)多肽鏈N末端氨基酸序列對穩(wěn)定性影響：相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr真核生物蛋白質(zhì)，在真核和原核細胞中半衰期通常很短,尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞內(nèi)蛋白酶超敏感區(qū)。新版大腸桿菌基因工程第80頁四、基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性及其對策基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)與機制改進基因工程菌不穩(wěn)定性策略新版大腸桿菌基因工程第81頁1)工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)形式基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒不穩(wěn)定性，這種不穩(wěn)定性含有兩種表現(xiàn)形式：重組DNA分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，造成其表觀生物學(xué)功效喪失整個重組DNA分子從受體細胞中逃逸（curing）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性分配不穩(wěn)定性1.基因工程菌遺傳不穩(wěn)定性表現(xiàn)與機制新版大腸桿菌基因工程第82頁2)工程菌遺傳不穩(wěn)定性產(chǎn)生機制能量、物質(zhì)匱乏和外源基因表示產(chǎn)物毒性誘導(dǎo)受體細胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成路徑，開啟降解程序。受體細胞中限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子降解外源基因高效表示嚴重干擾受體細胞正常生長代謝這是重組質(zhì)粒逃逸基本原因重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配受體細胞中內(nèi)源性轉(zhuǎn)座元件促進重組分子缺失重排新版大腸桿菌基因工程第83頁3)重組質(zhì)粒逃逸率當含有重組質(zhì)粒工程菌在非選擇性條件下生長時，培養(yǎng)系統(tǒng)中一部分細胞不再攜帶重組質(zhì)粒，這些空載細胞數(shù)與總細胞數(shù)之比稱為稱為重組質(zhì)粒宏觀逃逸率。重組質(zhì)粒逃逸原因有：高溫培養(yǎng)、表面活性劑（SDS）、藥品（利福平）、染料（吖啶）促使重組質(zhì)粒滲漏；受體細胞中核酸酶降解重組質(zhì)粒；重組質(zhì)粒在受體細胞分裂時不均勻分配，細胞所含重組質(zhì)粒拷貝數(shù)差異伴隨細胞分裂次數(shù)增多而加劇。新版大腸桿菌基因工程第84頁2.改進基因工程菌不穩(wěn)定性策略1)改進載體受體系統(tǒng)以增大質(zhì)粒穩(wěn)定性為目標構(gòu)建方法包含：將R1質(zhì)粒上parB基因引入表示型載體中，其表示產(chǎn)物可以選擇性地殺死因為分配不均勻所產(chǎn)生無質(zhì)粒細胞；正確設(shè)置載體上多克隆位點，禁止DNA片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi)將受體細胞致死性基因安裝在載體上，同時構(gòu)建條件致死性對應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌ssb基因（DNA單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）。新版大腸桿菌基因工程第85頁2）施加選擇壓力依據(jù)載體上抗藥性標識，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對應(yīng)抗生素藥品和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素依據(jù)載體上營養(yǎng)缺點型標識，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加對應(yīng)營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高新版大腸桿菌基因工程第86頁3）控制目標基因過量表示使用可控型開啟子控制目標基因定時表示及表示程度使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒定時增殖或降低質(zhì)粒拷貝數(shù)4）優(yōu)化基因工程菌培養(yǎng)工藝培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度：較低培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒穩(wěn)定新版大腸桿菌基因工程第87頁六、利用重組大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素胰島素結(jié)構(gòu)及其生物合成人胰島素生產(chǎn)方法重組人胰島素大腸桿菌工程菌構(gòu)建新版大腸桿菌基因工程第88頁(一)胰島素結(jié)構(gòu)及其生物合成SSSSCNSSB肽（30）C肽（31）A肽（21）RRRKSSSSCNSSNC高爾基體內(nèi)特異性肽酶NC信號肽B肽C肽A肽信號肽酶新版大腸桿菌基因工程第89頁（二）人胰島素生產(chǎn)方法1.直接提取法制人胰島素早期人胰島素是從人胰臟中直接分離純化，因為原料供給限制，其產(chǎn)量遠遠不能滿足日益增多糖尿病人臨床需求。新版