皮革抗菌性能的測定Leather—Determinationofantimicrobialactivity-2024-03-15發布2024-10-01實施I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定起草。本文件是GB/T43722《皮革抗菌性能的測定》的第1部分。GB/T43722已經發布了以下部分：——第1部分：膜接觸法。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中國輕工業聯合會提出。本文件由全國皮革工業標準化技術委員會(SAC/TC252)歸口。本文件起草單位：通標標準技術服務(上海)有限公司、浙江通天星集團股份有限公司、大康控股集團有限公司、深圳市北測檢測技術有限公司、上海應用技術大學、西南交通大學、廣東省科學院微生物研究所(廣東省微生物分析檢測中心)、天創時尚股份有限公司、廣東新虎威實業投資有限公司、江蘇集萃先進纖維材料研究所有限公司、朗盛化學(中國)有限公司、博富科技股份有限公司、上海市徐匯區疾病預防控制中心、上海潤河納米材料科技有限公司、中國皮革制鞋研究院有限公司、中輕檢驗認證有限公司、中關村匯智抗菌新材料產業技術創新聯盟。Ⅱ皮革產品作為皮膠原蛋白質的加工產品，加工過程中使用的原輔料中含有大量的油脂、糖類等成分，是細菌、霉菌生長的良好營養源，再加上皮革結構的多孔性和極性結構使其容易吸濕，從而導致其在保存和使用過程容易受到微生物的侵入，不僅在皮革表面形成白色、藍色、黃色或黑色的菌斑或色斑，而且還能向革內發展，使皮革的耐磨、強度和彈性等性能降低，嚴重影響其外觀及使用性能。此外，隨著人們對于預防疾病的意識不斷增強，各類抗菌材料和產品成為人們關注的對象，明示或宣傳有抗菌性能的皮革制品也逐漸成為決定市場競爭力的重要因素之一。皮革產品根據其來源、加工過程等分為不同的類型。如根據表面吸水性的差異，可分為表面不吸水皮革和表面吸水性較強的皮革；根據皮革抗菌劑溶出性的不同，可分為非溶出型抗菌皮革和溶出型抗菌皮革等。皮革抗菌性能的測定可以根據皮革種類采用適合的檢測方法。GB/T43722旨在為皮革抗菌性能的測定提供依據，擬由四個部分構成。——第1部分：膜接觸法。目的在于確立適用于表面不吸水皮革抗菌性能測定的定量試驗方法。——第2部分：瓊脂平皿擴散法。目的在于確立皮革抗菌性能測定的定性試驗和評價方法。——第3部分：菌液吸收法。目的在于確立適用于表面吸水性很強的皮革抗菌性能測定的定量試驗方法。——第4部分：振蕩法。目的在于確立其他膜接觸法和菌液吸收法不適用的皮革(尤其適用于使用了非溶出型抗菌劑的皮革)抗菌性能測定的定量試驗方法。1皮革抗菌性能的測定第1部分：膜接觸法警示——本文件涉及的微生物可感染致病，操作人員應采取一切必要的防護措施，避免對人員和環境的危害。試驗應由經過微生物學培訓且具有實踐經驗的專業人員在具備處理微生物技術條件的實驗室中進行。本文件描述了膜接觸法測定皮革抗菌性能的定量試驗方法。本文件適用于不吸水皮革抗菌性能的測定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。QB/T2707皮革物理和機械試驗試樣的準備和調節3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。采用化學或物理方法殺滅或妨礙細菌和真菌生長繁殖，以減少其數量以及活性的能力。對照樣controlsample未經抗菌處理、用于驗證試驗微生物生長條件的樣品。4原理通過接種定量微生物至不吸水的皮革試樣表面，用貼膜的方法使微生物均勻接觸試樣表面，經一定時間培養后，測定試樣表面的活菌數，計算抗菌率，以此表示試樣的抗菌性能。5儀器設備5.1恒溫培養箱，控溫精度為±1℃。5.2冷藏箱，溫度能夠保持在2℃~10℃。5.3二級生物安全柜。25.4生物光學顯微鏡。5.5壓力蒸汽滅菌器，溫度能保持在(121±2)℃,壓力能保持在(103±5)kPa。5.6培養皿，直徑為90mm。5.7紫外燈。5.11模刀，符合QB/T2707的規定，內壁為(50±2)mm×(50±2)mm的矩形。6試劑和材料6.1除特殊說明外，所用試劑均為分析純，試驗用水應為蒸餾水或去離子水。6.4氯化鈉(NaCl)溶液，0.85%(質量分數)。6.5無水磷酸氫二鈉(Na?HPO?)。6.6磷酸二氫鉀(KH?PO?)。6.7乙醇溶液，70%(體積分數)。6.8磷酸緩沖液(PBS),將2.83gNa?HPO?(6.5)和1.36gKH?PO?(6.6)加入至1000mL蒸餾水中，待完全溶解后，用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.1～7.4,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。6.9洗脫液，采用D/E中和肉湯(Dey-EngleyNeutralizingBroth)作為洗脫液。將5.0g胰蛋白胨、吐溫-80,加入至1000mL蒸餾水中，置于錐形瓶中混合并在沸水浴中充分溶解。然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。6.10覆蓋膜，采用聚乙烯薄膜，尺寸為(40±2)mm×(40±2)mm,也可與試樣尺寸相適應，厚度為0.05mm～0.10mm。用乙醇溶液(6.7)浸泡10min,再用蒸餾水沖洗，自然晾干。也可使用均質袋切下6.11對照樣，聚乙烯片材質，厚度<10mm,尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm,與試樣尺寸一致。也可使用均質袋切下的膜。7培養基7.1營養肉湯培養基(NB)將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨和5.0g氯化鈉與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。7.2營養瓊脂培養基(NA)將5.0g牛肉膏、10.0g蛋白胨、5.0g氯化鈉和15.0g瓊脂與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。37.3馬鈴薯培養基(PDA)將5.0g馬鈴薯浸粉、20.0g葡萄糖、20.0g瓊脂和0.1g氯霉素與1000mL蒸餾水混合，加熱煮沸至完全溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為5.8～6.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。7.4平板計數瓊脂(PCA)將2.5g酵母粉、5.0g胰蛋白胨、1.0g葡萄糖和15.0g瓊脂與1000mL蒸餾水混合，加熱溶解，然后用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。8試驗菌種8.1菌種試驗菌種通常至少采用3種，如下所示。——革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(細菌，ATCC6538或CGMCC1.2465)。——白色念珠菌(真菌，ATCC10231或CGMCC2.2086)。也可根據客戶要求選用其他菌種，應至少包括細菌和真菌，其中細菌種類至少含有1種革蘭氏陽性和1種革蘭氏陰性菌種，并在報告中注明試驗菌種及編號。所有菌種均應由國家相應菌種保藏管理中心提供。選用其他菌種時，培養基成分、培養溫度和培養方法可根據需要調整。8.2菌種保存對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將菌種接種于NA(7.2)斜面上，在(37±1)℃下培養18h～24h;對于白色念珠菌，將菌種接種于PDA(7.3)斜面上，在(28±1)℃下培養24h～48h。然后置于5℃~10℃下保存(不應超過1個月),作為斜面保存菌。9試驗菌液的制備9.1接種液的制備用NaCl溶液(6.4)稀釋NB培養基，用于金黃色葡萄球菌培養的NB質量分數為1%,用于大腸桿菌培養的NB質量分數為0.2%,白色念珠菌采用磷酸緩沖液(PBS)配制。用NaOH溶液(6.2)或HCl溶液(6.3)調節pH為7.0～7.2,分裝后置于壓力蒸汽滅菌器中，(121±2)℃條件下滅菌15min。為便于菌種分散可加入少量表面活性劑(如吐溫-80等)。9.2菌種活化對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將斜面保存菌轉接至NA(7.2)平板上，在(37±1)℃下培養18h～24h,再連續轉接1次后(在5代以內)的新鮮菌種培養物(24h內培養物)用于菌懸液的制備；對于白色念珠菌，將斜面保存菌轉接到馬鈴薯培養基(PDA)平板上，在(28±1)℃下培養24h～48h,再連續轉接1次后(在5代以內)的新鮮菌種培養物(48h內培養物)用于菌懸液的制備。9.3菌懸液的制備用接種環(5.8)從9.2的新鮮菌種培養物上取1環～2環新鮮菌種，加入到20mL接種液(9.1)中，用顯4微鏡觀察法或其他合適的方法估計活菌數目，10倍梯度稀釋并選擇菌液濃度為2.5×10?CFU/mL~10.0×10?CFU/mL的稀釋液作為試驗菌液。該試驗菌液冰冷3℃~4℃保存，在4h內使用。10試樣的準備10.1試樣和對照樣的取樣試樣：用模刀從粒面切取6塊尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm的試樣，試樣厚度不應大于5mm。3片用于“0”接觸測試，3片用于規定時間的接觸測試。若試樣尺寸無法滿足切取條件，可切取6塊尺寸不小于(20±1)mm×(20±1)mm的試樣，同時覆蓋膜聚乙烯薄膜也相應減小。對照樣(6.11):6片，3片用于“0”接觸測試，3片用于規定時間的接觸測試。10.2試樣和對照樣的滅菌通常采用紫外燈處理滅菌，將試樣和對照樣的正反面在紫外燈下分別照射滅菌。也可選用其他適宜的滅菌方法，試樣的滅菌處理應以不影響試樣的抗菌性能為原則。如采用其他滅菌方法，應在試驗報告中注明。11試驗步驟將試樣和對照樣分別放入滅菌培養皿中，保持待測面向上，用移液管分別移取0.4mL菌懸液(9.3),緩慢滴加到每個試樣和對照樣的待測面上，然后將聚乙烯薄膜(6.10)覆蓋于菌液上，調節使菌液分散到整個聚乙烯薄膜，注意避免菌液從薄膜邊緣溢出，蓋上培養皿的上蓋。每組試樣做3個平行若試樣尺寸較小，可移取0.1mL～0.4mL菌懸液，使貼膜后試樣表面的菌液中含菌數量達到1.0×10?CFU/片～4.0×10?CFU/片。有些試樣表面很難防止菌液溢出，可通過增加惰性增稠劑(如質量分數為0.1%～0.3%的瓊脂等)以增加菌液的黏度，防止溢出，并在試驗報告中注明。如果因樣品表面的花紋很難防止菌液溢出，可以通過“倒貼膜”的方法進行測試。試樣尺寸調整為(40±2)mm×(40±2)mm,聚乙烯薄膜(6.10)尺寸為(50±2)mm×(50±2)mm。菌懸液(9.3)中增加惰性增稠劑以增加菌液的黏度，用移液管移取0.4mL菌懸液，緩慢滴加到每個聚乙烯薄膜(6.10)表面，將試樣待測面朝下，覆蓋于菌液上，調節使菌液分散到整個試樣，注意避免菌液從試樣邊緣溢出。如采用該方法，應在試驗報告中注明。對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌，將接種后的試樣和對照樣在(37±1)℃、相對濕度≥90%的條件下培養24h;對于白色念珠菌，將接種后的試樣和對照樣在(28±1)℃、相對濕度≥90%的條件下培養分別量取20mL洗脫液(6.9)到3個“0”接觸時間的試樣和對照樣中，充分洗脫后，取一定量的洗脫5液，用10倍稀釋法系列稀釋至合適稀釋倍數。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于平板計數瓊脂(PCA)中，每個稀釋倍數制作兩個平行樣，在(37±1)℃下培養24h～48h。白色念珠菌接種于馬鈴薯培養基(PDA)中，在(28±1)℃下培養48h～72h,然后進行活菌計數。分別量取20mL洗脫液(6.9)到培養后的試樣和對照樣(11.2)中，充分洗脫后，取一定量的洗脫液，用10倍稀釋法系列稀釋至合適稀釋倍數。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌接種于平板計數瓊脂(PCA)中，每個稀釋倍數制作兩個平行樣，在(37±1)℃下培養24h～48h。白色念珠菌接種于馬鈴薯培養基(PDA)中，在(28±1)℃下培養48h～72h,然后進行活菌計數。如試驗菌懸液(9.3)中增加惰性增稠劑以增加菌液的黏度，洗脫時需要采用機械攪拌，如均質、旋動或超聲波振動等，需驗證這些方法的回收有效性后方可采用。注：對于厚度較大的皮革，適當增加洗脫液的用量，并在試驗報告中注明。用肉眼觀察(必要時可用放大鏡或菌落計數器),記錄稀釋倍數和相應的菌落數量，以CFU表示。選取菌落數在30CFU～300CFU、無蔓延菌落生長的平板記錄菌落總數。小于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個稀釋倍數的菌落數取兩個平板的平均數。若平板有較大片狀菌落生長時，不宜采用，應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋倍數菌落數；若片狀菌落生長不到平板的一半，另一半中菌落分布比較均勻，可計算半個平板后乘以2,代表該平板中的菌落數。當平板出現菌落間無明顯界限的鏈狀生長時，將每條單鏈作為一個菌落計數。12結果計算與表示試驗結果以試樣中的活菌數表示，按公式(1)進行計算：式中：N——每個試樣的活菌數，單位為菌落形成單位每片(CFU/片);C—菌落數平均值，單位為菌落形成單位(CFU);D——稀釋倍數；V——洗脫液體積與計數時所取洗脫液體積的比值。活菌數N的計算結果保留兩位有效數字。在V為20的情況下，對菌落數小于1的情況活菌數試驗結果記為小于20。試驗結果取3個試樣中的活菌數的算術平均值，保留兩位有效數字。當活菌數小于20時，用20進行平均值計算，保留兩位有效數字。12.2試驗的有效性當試驗同時滿足以下3個條件時，則試驗有效，否則應重新取樣進行試驗：a)3個對照樣的“0”接觸時間的活菌數應符合(最高對數值一最低對數值)/平均活菌數值對數值≤0.2的要求；b)3個對照樣“0”接觸時間