1貓呼吸道癥候群病原分子快速診斷重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法本文件規(guī)定貓呼吸道癥候群重組酶介導(dǎo)鏈替換核酸擴(kuò)增法(GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范貓杯狀病毒：felinecaliciviru貓杯狀病毒屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)水皰疹病毒屬病毒(Vesivirus)病毒貓皰疹病毒：felineherpesvi貓皰疹病毒屬皰疹病毒科，甲型皰疹病毒亞科病毒，外有囊膜，雙股的DNA，于細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行增貓支原體：felinemycoplas體攝入細(xì)胞內(nèi)，主要引起貓支原體肺炎、上呼吸道感染和慢性支氣2貓波氏桿菌：bordetellabronchisep貓波氏桿菌是一種需氧革蘭氏陰性菌,主要影響貓的呼吸道系統(tǒng)，出現(xiàn)流鼻涕、打噴嚏咳嗽呼酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，在DNA聚合酶的作用下，邊轉(zhuǎn)錄邊形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長。利用熒光探針的標(biāo)記，隨著RAA反應(yīng)的進(jìn)行，RAA產(chǎn)物與熒光信號的增長呈一種重組酶介導(dǎo)鏈替換的恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)(簡稱RT-RAA技術(shù))。利用從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶，在恒溫下(一般為37℃~42℃),該重組酶可與引物緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，在單鏈DNA結(jié)合蛋白SSB的幫助下，打開模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，在逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的作用下，邊轉(zhuǎn)錄邊形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級增長。利用熒光探針的標(biāo)記，隨著RAA反應(yīng)的進(jìn)行，RAA產(chǎn)4符號和縮略語A——260nm處的吸光值N——核酸稀釋倍數(shù)3BS-RecA：枯草芽孢桿菌重組酶(Bacillussubtilisrecombinase)Bsu：枯草芽孢桿菌(BacillussubDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）RNA：核糖核酸（ribonuleicacid）RT-RAA：反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增（Reversetranscription-recombinase-aidamplificaSC-RecA：天藍(lán)色鏈霉菌重組酶（Streptomyce參照NY/T541—2016中6.12眼部組織和和分泌物樣品、6.19呼吸道后的DNA/RNA為模板，分別采用貓杯狀病毒、貓皰疹病毒、貓支原體、貓衣引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RAA/RT-RAA擴(kuò)增，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光的增幅情況，實(shí)現(xiàn)對貓呼吸道癥候群病原貓皰疹病毒實(shí)時(shí)RAA熒光檢測所用的引物探針參見附錄貓支原體實(shí)時(shí)RAA熒光檢測所用的引物探針參見附錄貓衣原體實(shí)時(shí)RAA熒光檢測所用的引物探針參見附Na?EDTA。7.5TE緩沖液(pH8.0)：10mmol/LTris-H4逆轉(zhuǎn)錄酶，250mmol/LTricine，12.5mmol/振蕩混勻后于70℃孵育15min，期間顛倒離心管2-3次；12000r/min離心5m4℃靜置30min，4℃下12000r/min離心3min，小心棄去上清液；加入700μL70%乙醇,重懸沉淀，12000或-80℃凍存?zhèn)溆谩?.3.1RT-RAA擴(kuò)增反應(yīng)總體系貓杯狀病毒實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光擴(kuò)增反應(yīng)總體系5貓皰疹病毒/貓支原體/貓衣原體/貓波氏桿菌實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光擴(kuò)增反應(yīng)總體系見附錄9.5實(shí)時(shí)熒光RAA/RT-RAA擴(kuò)增反應(yīng)RAA擴(kuò)增靈敏度高使得其容易污染導(dǎo)致假陽性，因此應(yīng)高度重視擴(kuò)增產(chǎn)物的污染問題，反應(yīng)過程檢測過程中防止交了污染的措施按照GB/T27401規(guī)7A.1貓杯狀病毒RT-RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因貓杯狀病毒F:TTTGGAGCATTACAACAGCCAGTTTAATGGORF1R:AATATTTAAGCACGTTAGCGCAGGTTGAGP:ATTCGAGTGGCATGACCGCCCTACACTGTGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GTTCGAAGTTTGAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.1。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BQH-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。A.2貓皰疹病毒RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因貓皰疹病毒F:AATGCTATACTGGCGTAGTCTCTTTGAAA247bpTKR:GGCGAGAGGGTGTCTATCTATGATTAGGGP:GTCTCTTTGAAACTGATGTTGTCGGTGG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]CTATGCCGTCCAGGA-C3注：目的基因序列參見附錄D.2。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。A.3貓支原體RAA引物序列名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因貓支原體F:AGAAGCACTTGCAGGAGATAACGCTGGATTEF-TuR:AATTCTGTGTGAGGGATAATTGAACCTGP:TGGATTATTACTTCGTGGAGTAAACCGTGAAGA[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]TGAACGTGGACAAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.3。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。8名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因貓衣原體F:TAGAAATCAATAAAACAGACGGAGGCACApmp9R:ACTAAAGATCCTGCGGATAGGGTAATAGGP:AAACAGACGGAGGCACAAGCTATACGGG[FAM-dT][THF][BHQ1-dT]GATCATCTTTTCAG-C3注：目的基因序列參見附錄D.4。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。名稱引物/探針序列(5'→3')擴(kuò)增片段長度靶基因貓波氏桿菌F:TAAGTCCGTCGCAAACCTGCCGTAATCC203bpflaAR:CGATTGGGACTTGTTCAGGTTGTTCTGGP:GCTGCCCGGTTTGAAGAAGCCTTTCTC[FAM-dT]C[THF][BHQ1-dT]GGGAGCCTCAACATGG-C3注：目的基因序列參見附錄D.5。F為上游引物，R為下游引物，P為探針，F(xiàn)AM-dT,THF,BHQ1-dT和C3spacer均為探針修飾基團(tuán)。9C.1貓杯狀病毒實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄熒光RT-R試劑體積/μL實(shí)時(shí)熒光RT-RAA擴(kuò)增體系（凍干粉）20啟動劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板反應(yīng)總體系25C.2貓皰疹病毒/貓支原體/貓衣原體/貓波氏桿菌實(shí)時(shí)熒光RAA反試劑體積/μL實(shí)時(shí)熒光RAA擴(kuò)增體系（凍干粉）20啟動劑正向引物(10μmol/L)反向引物(10μmol/L)探針(10μmol/L)模板2.0反應(yīng)總體系25ttggaaaactccgccaaagacaatcgacccaacctcacgtggacaacagctctggaatgcgtgtttgtacgcaagccagcatggtgttgagttttacaataaagttgaagttggcagaaagagctgttgagtacgagggtctccacatcgaacccccaaattactactcagctttggagcattacaacagccagtttaatggtgtggacgcggtccgatcagatcaatttgagtgatgcaaccgcccttcactgtgatgtgttcgaagtttgagcatgtgctcaacctgcgctaacgtgcttaaatattatggggatcActgtccgcatttacatagatggtgcctatggaataggtaagagtttaacggcgaagtacctggtcagagcggatgaaaatcgaccgggatatacttactacttcccagaaccaatgctatactggcgtagtctctttgaaactgatgttgtcggtggtatctatgccgtccaggaccggaaacgacgtggtgaattatcagctgaagagcctatatcaccgcccactatcaagcaagatttgccgcaccataccttcttttacattccagactatccacaataacaggatatcagaaagttgtatgtgaggacccgacgtgaccctaatcatagatagacaccctctcgcctctctggtctgtttcccactcgcaagatattttgtgggtgatatgactcttgggtctgtacttagggcaacacttccacgagaacctcctggtggaaatctagttgtaacaaccttgaatatcgaggaacatttgaagcgtctcaggggacgctcaagaCgttgaccatggtaaaactacattaacagctgctatagctacagttttagctaaaaaaggtttatctgaagctcgtgattatgcttctattgataatgctccaggagcacgtggtattacaattaatacatcacacattgaatatcaaactgaaaaacgtcactatgctcacgttgactgtcctggtcacgctgactatgttaaaaacatgattacaggggcagctcaaatggatggtgctatcttagttgttgctgcaacagatggaccaatgcctcaaacacgtgaacacattcttttatctagacaagttggtgttcgtatcgttgttttcttaaacaaatgtgatatgttagaaggtgaagaagagatgattgaacttgttgaattagaagttcgttcacttctttcagaatacggatttgatggataatgctccaattattcgtggatctgctaaattagctcttgatggtgttcctcaatgagaagaaaaagttatg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