代替GB/T23884—2009動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定高效液相色譜法2021-10-11發(fā)布2022-05-01實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。高效液相色譜法》,與GB/T23884—2009相比，除結(jié)構(gòu)調(diào)整和編輯性改動(dòng)外，主要技術(shù)變化如下：膏和蠶蛹粉8種動(dòng)物源性飼料原料；修改了方法的檢出限，增加了定量限(見第1章，2009年版的第1章); 修改了衍生劑、衍生條件和衍生后處理方法(見5.11、8.2,2009年版的4.1、7.1.2、7.1.3)——修改了色譜梯度洗脫程序(見表1,2009年版的表1);——?jiǎng)h除了“6種生物胺的化學(xué)名稱、分子式和相對(duì)分子質(zhì)量”(見2009年版的附錄A);——修改了生物胺液相色譜圖(見附錄A,2009年版的附錄B)。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由全國(guó)飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC76)提出并歸口。本文件起草單位：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。本文件于2009年首次發(fā)布，本次為第一次修訂。1動(dòng)物源性飼料中生物胺的測(cè)定高效液相色譜法高效液相色譜測(cè)定方法。本文件檢出限為5mg/kg,定量限為10mg/kg。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備3術(shù)語(yǔ)和定義本文件沒(méi)有需要界定的術(shù)語(yǔ)和定義。4原理試樣中的生物胺經(jīng)高氯酸溶液提取、丹磺酰氯衍生，用高效液相色譜儀測(cè)定，外標(biāo)法定量。5試劑或材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純?cè)噭?.3丙酮。5.4氨水。5.6乙酸銨溶液(5mmol/L):稱取0.38g乙酸銨(5.5),加水溶解，定容至1L。5.7高氯酸提取液(0.4mol/L):準(zhǔn)確量取高氯酸32.3mL,用水定容至1L。5.8氫氧化鈉溶液(2mol/L):準(zhǔn)確稱取8g氫氧化鈉，用水定容至100mL。5.9飽和碳酸氫鈉溶液：向水中加入足量的碳酸氫鈉固體直到無(wú)法再溶解。5.10鹽酸溶液(0.1mol/L):準(zhǔn)確量取8.3mL濃鹽酸，用水定容至1L。25.11丹磺酰氯衍生溶液(10mg/mL):稱取1g丹磺酰氯(CAS號(hào)：605-65-2,≥99%),用丙酮溶解，定容至100mL。臨用現(xiàn)配。5.12標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1mg/mL):分別稱取色胺(CAS號(hào)：1476-39-7,純度≥99%)12mg、苯乙胺(CAS號(hào)：64-04-0,純度≥98%)13mg、腐胺·二鹽酸(CAS號(hào)：333-93-7,純度≥98%)18mg、尸胺(CAS號(hào)：462-94-2,純度≥98.8%)10mg、組胺(CAS號(hào)：51-45-5,純度≥97%)10mg、章魚胺·一鹽酸(CAS號(hào)：770-05-9,純度≥99.3%)12mg、酪胺(CAS號(hào)：51-67-2,純度≥98%)10mg、亞精胺·三鹽酸(CAS號(hào)：334-50-9,純度≥99.9%)17mg、精胺(CAS號(hào)：71-44-3,純度≥98%)10mg(精確至0.01mg),分別置于10mL棕色容量瓶中，用鹽酸溶液(5.10)溶解并定容。于一18℃以下保存，有效期為6個(gè)月。注：標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制濃度以各生物胺的單體計(jì)算，稱取標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)對(duì)其中的鹽酸鹽進(jìn)行折算。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液配制好后轉(zhuǎn)移至密閉棕色容器中，避光貯存。5.13混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(100μg/mL):準(zhǔn)確移取各生物胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(5.12)1mL于10mL棕色容量瓶中，用鹽酸溶液(5.10)定容。于2℃~8℃保存，有效期為1周。5.14混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：準(zhǔn)確移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(5.13)于10mL棕色容量瓶中，用水(5.1)稀6儀器設(shè)備6.1高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。6.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。6.3恒溫?fù)u床：控溫精度±1℃。6.4旋渦混勻器。6.5離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于5000r/min。6.6氮吹儀。6.7超聲波清洗器。6.8勻漿機(jī)。7樣品按GB/T20195制備樣品，至少100g,粉碎使其全部通過(guò)0.42mm孔徑的分析篩，充分混勻，裝入7.2膏漿狀按GB/T20195制備樣品，至少100g,用一臺(tái)機(jī)械攪拌器或均質(zhì)器混合樣品，邊搖邊用勺或大口吸管轉(zhuǎn)移100g或100mL樣品到磨口瓶中，避光保存，備用。8試驗(yàn)步驟平行做兩份試驗(yàn)。稱取試樣1g,準(zhǔn)確至0.0001g,置于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mL高氯酸提3取液(5.7),渦旋混勻(膏漿狀樣品均質(zhì)30s),置于搖床上，室溫下200r/min振蕩10min,于5000r/min離心10min,上清液倒入另一50mL離心管中，殘?jiān)儆?0mL高氯酸提取液(5.7)提取，重復(fù)上述操8.2衍生化準(zhǔn)確移取上清液(見8.1)1mL,放入15mL具塞離心管中，依次加入200μL氫氧化鈉溶液(5.8)、300μL飽和碳酸氫鈉溶液(5.9)和2mL丹磺酰氯衍生溶液(5.11),渦旋混勻，置搖床上，45℃避光反應(yīng)45min。加入100μL氨水(5.4)終止反應(yīng)，混勻，靜置15min,45℃氮?dú)獯等ケ靡译?5.2)定容至5mL,超聲復(fù)溶，混勻，用0.22μm有機(jī)微孔濾膜(5.15)過(guò)濾備用。精確量取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(5.14)各1mL與試樣溶液同時(shí)進(jìn)行衍生。8.3液相色譜參考條件色譜柱：C18柱，長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm,粒徑5μm,或性能相當(dāng)者。流動(dòng)相：乙酸銨溶液(5.6)和乙腈(5.2)(用前超聲脫氣)。梯度洗脫程序見表1。表1高效液相色譜梯度洗脫程序表時(shí)間乙酸銨溶液%乙腈%0558.4.1混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液測(cè)定在儀器的最佳條件下，分別取混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液(見8.2)上機(jī)測(cè)定。生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的液相色譜圖參見附錄A。以保留時(shí)間定性，試樣溶液中生物胺保留時(shí)間應(yīng)與混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液(濃度相當(dāng))中生物胺的保留時(shí)間一致，其相對(duì)偏差在±2.5%之內(nèi)。以生物胺的濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積(響應(yīng)值)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于4GB/T23884—20210.999。試樣溶液中生物胺的濃度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。如超出范圍，應(yīng)將上清液(見8.1)用高氯酸提取溶液(5.7)稀釋后，重新衍生測(cè)定。單點(diǎn)校準(zhǔn)定量時(shí)，試樣溶液中生物胺的濃度與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相差不超過(guò)30%。9試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理試樣中生物胺的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)w;計(jì)，數(shù)值以毫克每千克(mg/kg)表示。多點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(1)計(jì)算；單點(diǎn)校準(zhǔn)按公式(2)計(jì)算：P?——從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的試樣溶液生物胺i的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶的體積，單位為毫升(mL);V?——衍生化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位為克(g)。A;——試樣溶液中生物胺i的色譜峰面積；p、——標(biāo)準(zhǔn)溶液中生物胺i的質(zhì)量濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);V——試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);V?——氮?dú)獯蹈珊髲?fù)溶的體積，單位為毫升(mL);A;s——標(biāo)準(zhǔn)溶液中生物胺i的色譜峰面積；V?——衍生化時(shí)所用試樣提取溶液的體積，單位為毫升(mL);m——試樣質(zhì)量，單位