第第頁游離膽固醇（freecholesterol,FC）含量測定試劑盒說明書游離膽固醇（freecholesterol,FC）含量測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預期差異大的樣本做預測定。測定意義：FC是構成細胞膜的主要成分，也是合成腎上腺皮質激素、性激素、膽汁酸及維生素D等生理活性物質的重要原料。FC濃度可作為脂代謝的指標。測定原理：FC氧化酶催化FC生成△4膽甾烯酮和H2O2，過氧化物酶催化H2O2、4氨基安替比林和酚生成紅色醌類化合物，在500nm有吸收峰，其顏色深淺與FC含量成正比。自備儀器和用品：水浴鍋、可調式移液槍、酶標儀、96孔板、異丙醇和蒸餾水。試劑組成和配置：試劑一：異丙醇100mL（自備）；試劑二：液體20mL×1瓶，4℃保存；試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存；試劑四：液體40μL×1瓶，4℃保存；TC標準品：液體1mL×1支，0.5μmol/mL，4℃保存。FC的提取：1.組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測。2．細菌、真菌：先收集400500萬細胞或細菌到離心管內，棄上清，加1mL試劑一，超聲波破碎1min（強度20％，超聲2s，停1s），即FC待測液。3．血清（漿）樣品：直接測定。測定操作：1.酶標儀預熱30min，調節波長到500nm。2.FC工作液的配制：臨用前，吸取約0.8mL試劑二分別加入試劑三和試劑四瓶中，充分溶解后再全部轉移回試劑二瓶中，充分混勻，FC工作液置于37℃水浴10min。用不完的工作液4℃保存一周。3.標準管：依次在96孔板中加入20μLFC標準液和180μLFC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定A標準管。4.測定管：依次在96孔板中加入20μLFC待測液和180μLFC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定A測定管。5、空白管：依次在96孔板中加入20μL試劑一和180μLFC工作液，混勻，37℃靜置3h后于500nm測定A測定管。注意事項：1、標準管和空白管只要做一管。2、若測定管產生白色渾濁，可以將待測液用異丙醇稀釋2~5倍后測定，并在最后結果乘以相應倍數。計算公式：1.血清（漿）中FC含量計算：FC含量（μmol/dL）=C標準液×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）×100mL=50×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）C標準液：0.5μmol/mL；100mL：1dL=100mL。2.組織中FC含量計算：(1)按樣本蛋白濃度計算FC含量（μmol/mgprot）=C標準液×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）÷Cpr=0.5×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）÷Cpr(2)按樣本鮮重計算FC含量（μmol/g鮮重）=C標準液×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）÷W=0.5×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）÷WC標準液：0.5μmol/mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質量，g/mL3.細胞、細菌中FC含量計算：FC含量（μmol/104cell）=C標準液×（A測定管A空白管）÷（A標準管A空白管）÷細菌或細胞（104cell/L）=