馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofDickeyasolani2023-09-07發布國家市場監督管理總局國家標準化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草原則》的規定起草。請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗檢疫科學研究院、上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心、廣州海關技術中心。1馬鈴薯黑脛病菌檢疫鑒定方法1范圍本文件描述了馬鈴薯黑脛病菌的檢測和鑒定方法。本文件適用于進出境種球和塊莖等植物繁殖材料中馬鈴薯黑脛病菌的檢測、分離和鑒定。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成文本必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T1157進出境植物苗木檢疫規程SN/T2122進出境植物及植物產品檢疫抽樣方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4馬鈴薯黑脛病菌基本信息中文名稱：馬鈴薯黑脛病菌分類地位：細菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、溶果膠菌科/果膠桿菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌屬(Dickeya)。馬鈴薯黑脛病菌的相關信息見附錄A。5方法原理根據病害癥狀、菌落形態特征、自動微生物鑒定儀(Biolog)測試結果、煙草過敏性反應、致病性測試以及聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)儀檢測結果等進行病菌的分離、檢測和鑒定。6儀器設備和主要試劑6.1儀器設備及試劑6.1.1超凈工作臺。6.1.2培養箱。6.1.3恒溫孵育儀。26.1.5Biolog儀。6.1.7實時熒光PCR儀。6.2主要試劑除另有規定外，所有試劑均為分析純。7檢測流程病菌的分離、鑒定等檢測流程如圖1所示，檢測步驟可分步或同時進行。有癥樣品有癥樣品病菌分離疑似分離物PCR檢測致病性測試Bioloy測試煙草過敏性反應馬鈴薯黑脛病菌馬鈴薯黑脛病菌陰性8檢測鑒定8.1癥狀檢查8.2病菌分離圖1檢測流程圖和SN/T2122的規定取樣，觀察樣品上是否有變色和腐爛癥狀(見附錄A)。取癥狀樣品病健交界處組織0.1g～0.2g,使用70%酒精表面消毒30s,滅菌水洗3次后轉入離心管中，加入1mL滅菌水，浸泡15min,按照附錄B規定制作培養基，取浸出液在營養瓊脂培養基(NutritionAgarmedium,NA)平板上劃線分離；也可將浸出液稀釋10倍、100倍和1000倍后分別取100μL涂布NA平板，置于28℃下培養2d～3d后挑取疑似菌落，純化3次后用于后續試驗。典型菌3圖2NA培養基上的菌落分離物提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid,DNA),按照附錄C的規定進行常規PCR檢測或按照附錄D的規定進行實時熒光PCR檢測，陽性分離物進行后續測試，包括Biolog測試、致病性測試和煙草過敏性反應測試等。分離物在NA上培養24h后轉移至按照附錄B要求制作的BUG培養基上，置于30℃下培養24h,按照Biolog使用說明，調整菌懸液濁度加入GENⅢ微孔板中，每孔100μL。30℃下培養18h后8.5致病性測試分離物在NA上28℃培養24h后用滅菌水配成10?CFU/mL的菌懸液，針刺接種風信子和馬鈴后觀察發病情況。風信子接種癥狀如圖3所示，風信子葉片上病斑呈水漬狀，病健交界清晰，后期變色軟腐；馬鈴薯接種癥狀如圖4所示，馬鈴薯莖干迅速變褐，軟腐，并伴有惡臭。如出現上述癥狀，則從發病組織處分離其中病菌，PCR檢測分離物，根據檢測結果判斷接種分離菌和接種物是否是同種細菌，完成致病性測試。4圖4馬鈴薯上的接種癥狀(左側2株：Dickeyasolani;右側2株：無菌水)8.6煙草過敏性反應(可選)分離物在NA上28℃培養24h后用滅菌水配成10?CFU/mL的菌懸液，用滅菌注射器針頭注入普通煙草葉片背面表皮下，以滅菌水作為對照，28℃光照培養24h～48h,觀察煙草是否出現過敏性反應。9結果判定分離物的菌落形態特征與目標菌相符，常規PCR或實時熒光PCR檢測為陽性，且致病性測試為陽性，判定為馬鈴薯黑脛病菌Dickeyasolani。必要時(實驗室首次截獲、新寄主、新分布地等),增加Biolog測試和煙草過敏性反應，Biolog測試為Dickeyasolani,能引起煙草過敏性反應，判定為馬鈴薯黑脛病菌Dickeyasolani。10記錄和材料保存10.1試驗記錄10.2樣品保存樣品置于陰涼干燥處或冰箱中保存6個月。陽性樣品至少保存1年，以備復檢、談判和仲裁，樣品保存期滿后，應經高溫滅菌后處理。10.3菌株保存陽性分離物用30%甘油制成菌懸液，置于一80℃下保存1年；或凍干后于—20℃下保存。5(資料性)病菌基本信息A.1名稱及分類地位中文名：馬鈴薯黑脛病菌分類地位：細菌界(Bacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)、腸桿菌目(Enterobacteriales)、溶果膠菌科/果膠桿菌科(Pectobacteriaceae)、狄克氏菌屬(Dickeya)。A.2地理分布A.3寄主馬鈴薯(Solanumtuberosum)和風信子(Hyacinthusorientalis)。A.4傳播途徑病菌主要通過球莖、塊莖、花卉、觀賞植物等繁殖材料的調運進行遠距離傳播。田間傳播主要是通過土壤、雨水和灌溉水，病菌由傷口或皮孔侵入后感染發病。A.5生物學特征NA培養基上菌落圓形，扁平，邊緣略呈波紋狀，乳白色至淺黃色，不透明或略透明，表面有輕微褶皺，48h后菌落呈典型煎雞蛋狀，菌體桿狀，能動，大小0.9μm×2.0μm,生物3型，產生磷酸酶和吲哚，可利用D-阿拉伯糖、D-蜜二糖、D-棉籽糖、甘露醇，革蘭氏陰性，金氏B(King’sBmedium,KB)和NA培養基上39℃可生長。A.6癥狀病菌主要侵染莖基部和薯塊，在馬鈴薯生長期的各個階段均可發病。病菌主要通過帶病的種薯傳播，由傷口或莖皮孔侵入組織后發病，導致地下部塊莖腐爛與地上部植株莖腐及葉片枯死，如圖A.1和圖A.1馬鈴薯幼莖上腐爛癥狀圖A.2風信子種球上腐爛癥狀6病重的塊莖播種后，種薯不發芽，或剛發芽就爛在土中，不能出苗；有的幼苗出土后病害發展至莖部，很快死亡，常造成成苗率低。早期病株萎蔫枯死，常不能結薯。發病較輕或晚的植株，只有部分枝葉發病，病癥不明顯。病株結的塊莖，病菌從匍匐莖進入塊莖，受侵染的塊莖組織表面顆粒狀凹凸不平，質地軟化，呈乳白色至棕褐色。腐爛組織邊緣呈褐色至黑色，病健組織分界明顯，而后擴展致整個塊莖腐爛，最后只剩薄薄的外皮。病株的葉片多先從上部葉片發病向下部葉片擴展。發病初期，葉緣變枯干涸，逐漸延及至整個葉片，嚴重時全株枯死。維管束組織自莖基部開始變褐，逐漸延至上部，最終導致莖基部中空壞死。7(規范性)培養基的制作要求蒸餾水100調整pH至7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.2BUG瓊脂培養基(BUGagarmedium)BUG瓊脂培養基57.0g蒸餾水1000mL調整pH至7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.3金氏B培養基(King'sBmedium,KB)蒸餾水100調整pH至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。8(規范性)C.1引物引物為Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),源于鞭毛蛋白編碼(flagellin-C.2反應體系PCR反應體系25μL,包括2.5μL10×PCR緩沖液buffer(Mg2+plus),2.5μL脫氧核糖核苷三磷上下游引物(引物濃度各為5μmol/L),1μL模板DNA,1.5UTaq聚合酶(5U/μL),加水至25μL。也可使用等效的PCR預混液配制反應體系。以滅菌去離子水作空白對照，以D.solani的DNA作為陽性對照，以同屬其他種(如D.chrysanthemi或D.dadantii)DNA作為陰性對照。C.3反應條件(溫度/時間)PCR反應程序：94℃3min;94℃30s,65℃30s,72℃30s,循環35次；最后72℃10min。C.4結果判定PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠1×Tris乙酸鹽乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid,EDTA)緩沖液(Trisacetate-EDTAbuffer,TAE)電泳，溴化乙錠(Ethidiumbromide,EB)或核酸染料染色后用凝膠成像系統分析。陽性對照、陰性對照和空白對照均正常，分離物出現與陽性對照大小一致的491bp擴增產物，判定為陽性，無預期擴增產物或產物大小不一致判定為陰性。9(規范性)實時熒光PCRD.1引物及探針引物Ds4(5'-aatgctaacgacggcgta-3')/Ds5(5'-atggtgttgcccaggttctg-3'),探針P-Ds(5'-FAM-ct-tcagcggtatttaccag-MGB-3'),源于flic基因序列D.2反應體系反應總體積為20μL,包括：實時熒光反應混合液TaqManMasterMix10μL,10mol/L的上下游引物各1μL,10mol/L的探針1μL,DNA模板1μL。也可使用等效的實時熒光PCR預混液配制反應體系。以滅菌去離子水作空白對照，以D.solani的DNA作為陽性對照，以同屬其他種的DNA作為陰性對照。D.3反應條件(溫度/時間)PCR反應程序：95℃10min;95℃15s,60℃1min,40個循環。D.4結果判定陽性對照、陰性對照和空白對照均正常：——疑似分離物出現典型擴增曲線判定為陽性；無典型擴增曲線判定為陰性。——檢測樣品，出現典型擴增曲線，循環數閾(CycleThreshold,Ct)值情況可分為：Ct≤35時，判定為陽性；35<Ct<40,增加DNA增加用量至2μL～5μL再次測試，出現典型擴增曲線，且Ct≤35,判定為陽性；其余情況判定為陰性。GB/T43158—2023[1]StawiakM,LojkowskaE,VanderWolfJM.FirstreportofbacterialsoftrotonpotatocausedbyDickeyaspp.(syn.Erwiniachrysanthemi)inPoland.PlantPathology.2009,58:794.[2]TothIK,vanderWolfJM,SaddlerG,etal.Dickeyaspecies:anemergingproblemforpo-tatoproductioninEurope.PlantPathology.2011,60(3):385-399.[3]Tsror(Lahkim)L,ErlichO,LebiushS.,etal.AssessmentofrecentoutbreaksofDickeyasp.(syn.Erwiniachrysanthemi)slowwiltinpotatocropsinIsrael.Euro