楊樹細菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法2021-10-11發布I本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規則》的規定請注意本文件的某些內容可能涉及專利。本文件的發布機構不承擔識別專利的責任。本文件由全國植物檢疫標準化技術委員會(SAC/TC271)提出并歸口。1楊樹細菌性潰瘍病菌檢疫鑒定方法本文件描述了楊樹細菌性潰瘍病菌的癥狀檢查、分離培養、生化特征測定和分子鑒定的方法。本文件適用于進出境楊樹苗木等植物材料中攜帶楊樹細菌性潰瘍病菌的檢疫、檢測和鑒定，以及田間調查和病害監測工作。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。SN/T1193基因檢驗實驗室技術要求SN/T2601植物病原細菌常規檢測規范3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4病菌分類信息中文名：楊樹細菌性潰瘍病菌AplanobacteriumpopuliRidéXanthomonaspopulisubsp.populi分類地位：變形菌門(Proteobacteria),變形菌綱(Gammaproteobacteria),黃單胞菌目(Xan-thomonadaceae),黃單胞菌科(Xanthomonadaceae),黃單胞菌屬(Xanthomonas)。楊樹細菌性潰瘍病菌的相關資料參見附錄A。5方法原理楊樹細菌性潰瘍病菌的危害癥狀、菌落形態特征、煙草過敏性反應、生理生化特性，分子生物學特性以及致病性測試是本文件檢疫鑒定方法的原理。6檢測流程檢測流程見圖1。2待測樣品待測樣品癥狀觀察菌落形態觀察并挑取可疑菌落革蘭氏染色、鞭毛染色(初篩)煙草過敏性反應、生化特征測定(初篩)分子特異性檢測致病性測試按以上實驗步驟順序，若分子特異性檢測陰性則判定為未檢山楊樹細菌性潰瘍病菌按以上實驗步驟順序，若分子特異性檢測和致病性測試為陽性則判定為檢出楊樹細菌性潰瘍病菌圖1檢測流程7儀器及用具電子天平(分度值：1/10000g)、恒溫培養箱、高速冷凍離心機、掌上離心機、純水儀、生物顯微鏡、高壓滅菌器、聚合酶鏈反應核酸擴增儀(PCR儀)、電泳儀、凝膠成像儀、超低溫冰箱、紫外分光光度計、8主要試劑及培養基8.1試劑和材料除另有規定外，所有試劑均為分析純，所有試驗用水均為滅菌蒸餾水。(MgSO?·7H?O)、磷酸氫二鉀(K?HPO?)、溴酚藍(CgH?Br?O;S)、七葉靈(CisH?O?)、檸檬酸鐵3(FeC?H?O?)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、冰醋酸(C?H?O?)、氯化鎂(MgCl?)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、DNA聚合酶(Taq酶),氧化酶試紙條、細菌微量生化鑒定管、溴化乙錠(C??H20N3Br)、瓊脂蔗糖蛋白胨培養基、營養葡萄糖瓊脂培養基(NDA)配制按照附錄B操作。9檢疫鑒定方法9.1癥狀觀察楊樹的病害調查或進出境楊樹苗木的現場檢疫中，若發現枝條皮層產生裂縫，從裂縫中流出灰褐色細菌菌液，或樹干出現腫大的、瘤狀潰瘍斑(見A.2危害情況),取樣帶回實驗室做進一步分離鑒定。9.2寄主組織分離培養按照SN/T2601要求進行操作。取疑似潰瘍病癥狀的樹段進行病原菌的分離培養，表面用75%酒精消毒后，去除樹皮，把內部變色木材切成長度和厚度3mm～4mm的小塊，用無菌水清洗三次。在滅菌離心管中加入少量無菌水，將小塊病組織放入無菌水中，并用滅菌研磨棒對小塊病組織進行碾壓研磨，10min后用加樣槍吸取80μL病組織浸出液，在蔗糖蛋白胨培養基或NDA培養基平板上涂布分離，做不少于5個平板。平板置于25℃下培養4d～5d后觀察，若發現可疑菌落(特征為直徑3mm~4mm,圓形，輕微凸起，邊緣整齊，黃色奶油狀),則挑取單菌落進行純化培養。若發現染病苗木皮層裂縫流出菌液，可直接用接種環蘸取并在蔗糖蛋白胨培養基或NDA培養基平板上劃線分離，置于25℃恒溫培養箱中進行培養，每份樣品做不少于5個平板，培養4d～5d后挑取單菌落進行純化培養。9.3分離菌的鑒定9.3.1革蘭氏染色反應進行革蘭氏染色試驗，要設置陽性菌的對照。若染色結果為革蘭氏陰性菌，應進行鞭毛染色試驗。革蘭氏染色應采用3%氫氧化鉀(KOH)溶液進行檢測判斷。用牙簽挑取新鮮待測菌落放在載玻片上，與1滴氫氧化鉀溶液混勻，30s后用牙簽慢慢拉出，有拉絲現象的為革蘭氏陰性菌，無拉絲現象為革蘭氏陽性菌。9.3.2鞭毛染色反應若分離菌經生物顯微鏡觀察發現有鞭毛并且鞭毛極生，繼續進行生化指標的檢測。9.3.3煙草過敏性反應取分離的菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，用滅菌注射器接種煙草葉片背面，置于25℃光照培養，24h～48h觀察煙草葉片是否出現過敏性壞死反應。若葉片出現枯斑情況則為陽性反應，若出現黃斑或不明顯變化則為陰性反應。同時接種陽性菌株懸液和無菌水分別作為陽性對照和空白對照。采用微量生化鑒定管對可疑菌株和楊樹細菌性潰瘍病菌標準菌株進行生化指標檢測，該步驟也可4使用細菌自動鑒定系統等自動化生化指標檢測設備。楊樹細菌性潰瘍病菌的生化指標測定結果若為七葉靈水解陰性，明膠液化陰性，D-木糖、蜜二糖、棉子糖不產酸，能從甘露糖、半乳糖和果糖產酸，則繼續進行分子方法鑒定步驟。生化指標測定方法按照附錄B操作。9.3.5分子特異性檢測采用試劑盒提取細菌DNA。按照SN/T1193要求進行分子實驗的操作。根據楊樹細菌性潰瘍病菌RNA聚合酶σ-70因子的編碼基因(rpoD)設計特異性引物，擴增片段大小為160bp,檢測方法及步驟按照附錄C操作。采用楊樹感病品種的離體枝條，試驗在控溫的室內或培養箱中進行，溫度控制在20℃~25℃。將培養48h的供試菌株用無菌水配制成約10?CFU/mL菌懸液，將枝條截成約40cm長的段，在枝條中部切割韌皮部形成傷口，用無菌紗布蘸取菌懸液放置于傷口上，并用保鮮膜包裹，起到保濕的作用，同時接種陽性菌株懸浮液和無菌水分別作為陽性對照和空白對照。5d后觀察傷口處情況，若發現韌皮部具有軟腐癥狀且有變色情況出現，且在發病組織處分離到供試菌株，則證明供試菌株對楊樹有致病性。10結果判定分離得到的細菌菌株經過初篩試驗(菌落形態、革蘭氏染色、鞭毛染色、煙草過敏性試驗、生化特征測定)步驟檢測，若PCR特異性檢測為陰性，則判定未檢出楊樹細菌性潰瘍病菌。若PCR特異性檢測為陽性，且致病性測試為陽性，則判定檢出楊樹細菌性潰瘍病菌。11菌株保存與處理從檢測樣品中分離并鑒定為楊樹細菌性潰瘍病菌的菌株，應妥善保存。將菌株接種于營養葡萄糖瓊脂培養基(NDA)斜面上，23℃培養1d后轉入4℃低溫冰箱中保存，定期(約30d)轉接防止病菌死12結果記錄與資料保存完整的實驗記錄包括：樣品的種類、來源地、接樣(或采樣)時間、實驗的時間、地點、方法和結果等，并要有實驗人員和審核人員簽字記錄。5(資料性)楊樹細菌性潰瘍病菌相關資料A.1寄主植物楊屬(Populus)、銀白楊(PopulusalbaL.)、大葉鉆天楊(PopulusbalsamiferaL.)、加拿大楊A.2危害情況楊樹細菌性潰瘍病最早是于1934年在英國首次發現的，隨后很快傳播至幾乎整個歐洲，一直是歐洲楊樹生產中普遍而嚴重的病害。該病害可嚴重削弱樹木生長，發病嚴重時可造成樹木死亡，病樹死亡率一般可達12.0%～14.2%,感病樹種甚至可達37%。病樹主干的潰瘍斑使木材的加工利用價值大大降低。該病害還限制了某些栽培性狀優良但感病嚴重的楊樹品種和無性系的發展。楊樹細菌性潰瘍病主要危害10年生大樹，幼樹少見，1～2年生幼苗不會發生此病，主要危害主干和主枝。在感染初期，使樹干形成橢圓形、光滑的小瘤，腫瘤增大成明顯后，其韌皮部和木質部出現變色，夏季開裂流出棕褐色黏液，有臭味。病菌進入樹體后，在寄主的細胞間隙擴散，溶解細胞壁和中膠層，使細胞離解、崩潰，最終形成潰瘍斑，枝條皮層產生裂縫，從裂縫中流出灰褐色細菌菌液。樹木生長旺盛期，在病斑周圍產生愈傷組織，包圍病斑。病斑發展越過愈傷組織，進一步擴大，如此反復多次在樹干出現腫大的、有縱裂的瘤狀潰瘍斑，剖開病部，可見其下的皮層變褐、腐爛，大型潰瘍斑下面木質部的表面也往往變褐，病害發展到后期，形成增生的梭形瘤或長圓柱形瘤，最終木材變色，中心腐爛，整個植株呈禿頂狀。病害主要由雨水、昆蟲等傳播，經皮孔、傷口侵入危害，發病楊樹產生的黏液是重要的侵染源。A.3癥狀楊樹細菌性潰瘍病菌引起的癥狀見圖A.1。圖A.1楊樹細菌性潰瘍病菌危害癥狀6A.4形態特征單生，不產生聚β-羥基丁酸鹽顆粒，沒有鞘或附屬物。未知有休眠期。具單根極生鞭毛，以單極毛運動，嚴格好氧，以分子氧為終端電子受體。不能反硝化或硝酸鹽還原反應。最適生長溫度24℃~26℃。在含有葡萄糖的培養基上產生一種多糖黏液，即莢膜。在多種培養基上可產生黃色色素，色素是極具特征的溴化芳基多烯黃單胞菌素。A.5生化特性接觸酶試驗陽性，氧化酶試驗陰性，有機化能營養，不還原硝酸鹽。能利用不同的糖和有機酸鹽作為唯一的碳源。可利用多種糖產生少量酸，石蕊牛奶中不能產酸，能使甘露糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖發酵產酸，不能液化明膠，可利用乳酸鈣而不能利用谷氨酰胺生長，不能利用天門冬酰胺作為唯一的碳源和氮源。0.1%(通常為0.02%)氯化三苯四唑能抑制生長。通常必需的生長因子包括蛋氨酸、谷氨酸、核酸或其混合物。DNA的堿基(G+C)摩爾分數為62.1%～65.6%。A.6分布情況楊樹細菌性潰瘍病是楊樹重要檢疫性細菌病害，主要危害楊樹枝干，產生潰瘍斑，降低木材品質，導致樹木死亡。該病害在歐洲、北美、亞洲、大洋洲均有分布，在我國未見報道。A.7傳播途徑病菌潰瘍斑內越冬，春季病斑內細菌開始活動，細菌溢流出樹皮外，借風雨、流水、昆蟲和人為活動傳播，遠距離傳播主要是帶菌苗木、接穗等。昆蟲能攜帶病菌，在傳病過程中也起了重要作用。人工接種病菌的蚜蟲和其他昆蟲的傳病試驗已得到證實。從蛀蟲(Cypsonomaaceriana)的蟲癭上和取食幼樹的白楊透翅蛾(Sciapterontabaniformis)的消化道里及排出的糞便上均檢查出該病菌，因而推斷，這些昆蟲很可能是傳病的媒介，而土壤可能是病菌的自然棲息場所。A.8種以下階元分類目前楊樹細菌性潰瘍病菌[Xanthomonaspopuli(exRidé1958)Ridé&.Ridé1992]存在兩個亞種，即Xanthomonaspopulisubsp.populi和Xanthomonaspopulisubsp.salicis,其中后者是1977年M.DeKam在荷蘭的一種柳樹(Salixdasyclada)上發現的病原菌，根據國際細菌命名法規，作為一個亞種并入楊樹細菌性潰瘍病菌(Xanthomonaspopuli),兩個亞種可以通過寄主植物、菌落形態、有無運動性、耐鹽性高低及生化指標等加以區分。(規范性)培養基的配制和生化指標測定方法B.1培養基B.1.1蔗糖蛋白胨培養基蛋白胨5g,硫酸鎂0.25g,蔗糖20g,磷酸氫二鉀0.5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.2營養葡萄糖瓊脂培養基(NDA)牛肉浸膏3g,蛋白胨5g,酵母膏2g,葡萄糖10g,氯化鈉5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.3營養瓊脂培養基(NA)牛肉浸膏3g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂粉18g,蒸餾水1000mL。調整pH值至7.2～7.4,121℃濕熱滅菌15min。B.1.4休和利夫森二氏培養基蛋白胨2g,氯化鈉5g,葡萄糖10g,磷酸氫二鉀0.2g,瓊脂粉6g,溴酚藍(先用少量95%乙醇溶解后，再加水配成1%水溶液)3mL,蒸餾水1000mL