武義縣高中生物實驗技能提升培訓(二)武義縣高中生物實驗技能提升培訓（二）組織單位：縣教研室指導專家：藍偉偵培訓內容：幾種植物染色體體核型分析藍偉偵在作“染色體核型分析”講座材料：表1紫景天和四種龍葵的性狀比較種類果實顏色果實特征分布區紫景天黃果龍葵少花龍葵浙江龍葵蘇聯龍葵褐色黃綠色亮黑紫色黑色黑紫色果小，卵狀橢圓形粒細小，白中稍帶黃粒較小，白色稍泛綠粒較小,白色粒大,乳白色全國東北零星分布南方各省區浙江北部北方各省區紫景天、少花龍葵、浙江龍葵、黃果龍葵和蘇聯龍葵種子，由湖州師范學院張海洋教授提供，通過培養種子并獲得相應的根尖。表2各稻種的染色體數、基因組及地理分布稻種名稱Nameofspecies染色體數目Chromosomenumber基因組Genome分布Distribution（3）預處理：為了有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數，在固定之前應對剪下的根尖進行預處理，這樣可以改變細胞質的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成，促使染色體縮短和分散。預處理的方法有低溫預處理和藥物預處理。

=1\*GB3①低溫預處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內，置于4℃的冰箱中進行低溫處理24小時，此法效果很好，對染色體無破壞作用，染色體縮短均勻。=2\*GB3②藥物預處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對二氯苯溶液、8-羥基喹啉等。（4）根尖的低滲：低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/LKCl室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲15～30分鐘，使染色體分散效果更好。（5）固定：新鮮3：1甲醇：冰乙酸的固定液固定2～3h或4℃過夜。（借助于物理方法或化學藥物的作用，迅速滲入組織和細胞將之殺死，使其形態結構和內含物盡可能保持生活時的完整和真實狀態。固定時，將預處理過的根尖用蒸餾水沖洗兩次(約5分鐘)。然后移入卡諾氏固定液中，在4℃～15℃條件下固定20～24小時后用70％酒精沖洗2次轉入70％酒精中。在（6）水洗：每隔5分鐘洗一次，洗凈。（7）解離：2%纖維素酶、2%果膠酶、1%解析酶混合（2：2：1），28℃有酸解和酶解兩種方法：=1\*GB3①酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗，然后放入已經在60℃水浴鍋中預熱的1mol/LHCI中，在60℃恒溫條件下解離10～15分鐘，當根尖透明呈米黃色時取出，用蒸餾水沖洗2～3次。=2\*GB3②酶解：將根尖從固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸鈉中漂洗，用刀片切除根冠以及延長區(根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成2～3片)，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的2％的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中，在25～28℃條件下處理4～5小時。此時組織已被酶液浸透而呈淡褐色，質地柔軟而仍可用鑷子夾起，用滴管將酶液吸掉，再滴上0.1mol/L醋酸鈉，使組織中的酶液漸漸滲出，再放入45％醋酸。（8）后低滲：將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗2～3次(約10分鐘)。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡10～15分鐘，然后再沖洗2～3次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入70%酒精后備用。洗載片的洗滌如下：①1mol/LHCl中30分鐘以上=2\*GB3②自來水（每片單獨漂洗），接著用雙蒸水洗=3\*GB3③95%酒精浸泡30分鐘以上（9）染色體制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取1～2個根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開，火焰干燥。在普通光學顯微鏡進行觀察，通過鏡檢初步篩選一批染色體分裂像較多的制片，并用記號筆做好標記以便做熒光染色備用。（10）熒光染料DAPI復染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對紫景天染色體制片進行了熒光染色體。（11）熒光顯微鏡鏡檢及拍攝把復染的染色體制片利用熒光顯微鏡進行鏡檢，并且對染色體各時期分裂像都進行了一定量的拍照，并把拍攝好的照片在硬盤里備份保存。（12）圖像的處理及分析我們把拍攝好的染色體照片進行分析，首先選取分散較好的前中期染色體進行統計，并利用Photoshop軟件進行圖片處理和核型分析，SPOTadvanced軟件測量染色體長度，同時利用excel表對相關的數據進行分析統計，并構建其相應的核型模式圖。5.2龍葵染色體制片及觀察5.2.1龍葵的生根培養⑴浸種：分別取兩種龍葵的適量的種子于燒杯中，室溫下浸種一天。⑵發芽：培養皿中墊濕濾紙一層，種子分散其上，留一些間隔，不能堆積，25-30℃5.2.2種子培養過程觀察除了勤換水，保證種子處在最佳培養條件下外，還應及時取根尖。當根長至1-1.5cm時，切取1cm左右的根尖（早上10：00-11：00取根尖可以得到更好的分裂相），根尖太短，所得分裂細胞數目太少，不利于染色體觀察，太長，不利于制片。5.2.3根尖染色體制片⑴預處理為了有利于對有絲分裂中染色體的觀察和計數，在固定之前應對剪下的根尖進行預處理，這樣可以改變細胞質的粘度，抑制和破壞紡錘絲的形成．促使染色體縮短和分散。預處理的方法有低溫預處理和藥物預處理。

①低溫預處理：將剪取的根尖浸入盛有蒸餾水的燒杯內，置于4℃②藥物預處理：常用藥物有秋水仙素溶液、對二氯苯溶液、8-羥基喹啉等。⑵根尖的低滲低滲是為了使染色體更好的分散。在固定前用0.075mol/LKCl室溫下處理30分鐘，酶解后用蒸餾水低滲15-30分鐘，使染色體分散效果更好。

⑶固定與水洗借助于物理方法或化學藥物的作用，迅速滲入組織和細胞將之殺死，使其形態結構和內含物盡可能保持生活時的完整和真實狀態。固定時，將預處理過的根尖用蒸餾水沖洗兩次(約5分鐘)。然后移入卡諾氏固定液中，在4-15℃條件下固定20-24小時后用70％酒精沖洗2次轉入70％酒精中。在4℃冰箱內保存，保存時間最好不超過二個月。經過較長時間保存的材料，進行觀察前可以換用固定液再處理一次效果較好?；驅㈩A處理過的根尖放入0.075mol/LKCI溶液中低滲20分鐘，然后在蒸餾水中沖洗2-3次(約10分鐘)待用。

⑷解離使分生組織細胞間的果膠質分解．細胞壁軟化或部分分解．使細胞和染色體容易分散壓平。解離有酸解和酶解兩種方法：

①酸解：將根尖從固定液中取出，用蒸餾水漂洗．然后放入已經在60℃水浴鍋中預熱的1mol/LHCI中，在60℃恒溫條件下解離10-15分鐘，當根尖透明呈米黃色時取出，用蒸餾水沖洗2-3次。

②酶解：將根尖從固定液中取出，放在0.1mol/L醋酸鈉中漂洗，用刀片切除根冠以及延長區(根尖較粗的蠶豆，可以把分生組織切成2-3片)，把根尖分生組織放到醋酸鈉配制的2％的纖維素酶和2%果膠酶的等量混合液中,在25-⑸后低滲將解離后的根尖放在蒸餾水中沖洗2-3次(約10分鐘)。酶解后的根尖放入蒸餾水中浸泡10-15分鐘，然后再沖洗2-3次。一定要沖洗干凈，否則影響染色。低滲后的根尖放入70%酒精后備用。⑹洗載玻片①將載玻片置于1mol/LHCl中30min以上。②用自來水（每片單獨漂洗）漂洗，然后用蒸餾水漂洗。③將漂洗后的載玻片置于95%酒精中浸泡30min以上。5.2.4染色體制片用火焰干燥法制片：小心吸去酶液，水洗幾次，吸取1～2個根尖于干凈的干載玻片上，滴半滴固定液，用鑷子敲至漿狀，敲得越碎越好，滴至固定液使材料分散，迅速涂開，火焰干燥。用光學顯微鏡初步鏡檢，篩選備用。5.2.5龍葵染色體制片染色及觀察Giemsa染色（1）準備染液用pH為6.8-7.0的Sorense緩沖液，按Giemsa染液：Sorense緩沖液為1：20或1：40比例取Giemsa染液和Sorense緩沖液混合配成染色液。染色液宜現用現配，保存時間不超過48小時。緩沖液pH值要準確，否則影響染色效果。（2）Giemsa染色經過2ⅹssc處理后的片子在Giemsa染液中60℃下染色2-3小時。（3）洗片將經Giemsa染色后的片子用自來水洗去玻片上多余的燃料，自然干燥。熒光染料DAPI復染配制一定濃度的熒光染料DAPI，在暗室里對紫景天染色體制片進行了熒光染色體。5.2.6鏡檢及拍照晾干的片子在顯微鏡下鏡檢。每種類型隨機選取30個細胞進行染色體數目鑒定；每種類型選取染色體分散好的、形態清晰的5個細胞通過PhotoShop軟件和SPOT軟件結合G-帶帶型完成染色體核型分析。5.3水稻染色體制片中期染色體制片參照Song和Gustafson(1995)的方法并略作修改。切取生長旺盛的根尖(1~2mm)，0.075MKCl前低滲處理30min，甲醇/冰醋酸(3:1)固定，雙蒸水充分清洗根尖，2%的果膠酶及纖維素酶1:1混合28oC下酶解3~4h，雙蒸水后低滲30min火焰干燥制片，-20o藥用野生稻減數分裂染色體制片參照Kurata等(1981)程序稍加修改，在花粉母細胞處于減數分裂時期，以卡諾氏固定液固定幼穗后，從小穗中剝取花粉囊，用2%果膠酶(SERVA)和2%纖維素酶(SERVA)1:1混合，在28oC下酶解1.5~2.5h左右，吸去酶液，輕輕水洗3次，火焰干燥法制片，亦可用滴片法制備粗線期染色體，即將酶解好的花粉囊，加雙蒸水輕輕吹打，使其細胞完全散開，后低滲15min，3000~3600rpm離心5min，然后加固定液重新固定10~15min，換新鮮固定液，懸浮滴片，火焰干燥后-20oC保存備用。5.4染色體原位雜交及信號檢測5.4.1原位雜交參照Gustafson和Dille(1992)方法并略作修改。1)染色體制片60℃烘片1h。2)37℃于RNaseA(10μg/ml，用2×SSC稀釋)溶液中處理1h。3)4％多聚甲醛(2×SSC)室溫下處理10min。4)2×SSC，室溫下處理5min。5)2×SSC，室溫下處理10min。6)70%甲酰胺70℃處理3.5min。7)于-20℃70%、95%、100%乙醇中各處理5min。8)染色體制片在室溫下充分干燥。9)雜交液90℃變性10min后，迅速于冰上放置20min。雜交液配方見表1。表5FISH雜交液配方探針類型去離子甲酰胺硫酸葡萄糖探針量鮭精DNA(ssDNA)20×SSCSDS探針50%8%100ng2μg10%0.1%10)加50μl雜交液至染色體制片上，蓋24×50mm的蓋玻片，注意不要產生氣泡，80℃共變性1.5~3min(變性時間根據不同染色體制片而定)，染色體制片于37℃保濕皿中孵育24h。2.3.7.2信號檢測對于中期、間期、粗線期染色體制片，雜交后的熒光檢出程序包括以下步驟：1）洗片：20％甲酰胺，42℃洗10min；2×SSC，42℃10min；0.2×SSC，42℃10min；1×PBS室溫洗10min。2）涼干片子每張片子加50μl鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3)(0.4μl1mg/ml的鏈親和素-Cy3用1%BSA/PBS稀釋成50μl)或抗地高辛-FITC(anti-Digoxigenin-FluoresceinFabFragment)(3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。3）涼干片子每張片子加50μl生物素鏈親和素(BiotinylatedStreptavidin)(0.4μl1mg/ml的生物素鏈親和素用1%BSA/PBS稀釋成50μl)或兔抗羊-生物素偶聯物(rabbitanti-goatbiotinconjugated)(3μl200μg/ml的抗地高辛-FITC用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。4)涼干片子每張片子加50μl鏈親和素-Cy3(streptavidin-Cy3)(0.4μl1mg/mL的鏈親和素-Cy3用1%BSA/PBS稀釋成50μl)，37℃于保濕皿中溫育1h。室溫1×PBS洗3次，每次5min。5）每張制片加40μl10μg/mLDAPI復染，OLYMPUSBX61顯微鏡觀察，用CaseDataManagerExpo2.1.1圖象系統控制的Cool-1300QSCCD(VDS，Germany)照相系統攝取圖片，FISHViewEXPO2.0軟件圖片處理和核型分析。6實驗結果相關的實驗結果，見培訓課件ppt。作者簡介：藍偉偵性別：男民族：畬族出生年月日：1980年12月13日，籍貫：浙江武義簡歷：1999.09－2003.07本科中南民族大學生物技術專業2003.09－2006.07碩士中南民族大學分析化學專業2006.08－2009.07浙江湖州師范學院生科院2009.08－至今武義縣第三中學簡介：項目負責人近年來先后參加了多項科研項目，包括國家高技術發展計劃（863）（批準號：2004AA227120），教育部留學回國人員啟動基金（批準號：BZY04003），中國博士后科學基金（批準號：20040350574），武漢市青年科技晨光計劃（批準號：2004500607135）。負責人以第一作者發表或待發表文章：1.LanWZ,QinR,LiG,HeGC.ComparativeanalysisofA,B,CandDgenomesinthegenusOryzawithC0t-1DNAofCgenome.ChineseScienceBulletin,2006,51(14):1710-1720(SCI)2.LanWZ,HeGC,WangCY,WuSJ,QinR.ComparativeAnalysisofGenomesinOryzasativa,O.officinalis,andO.meyerianawithC0t-1DNAandGenomicDNAofCultivatedRice.Agricul