鉤端螺旋體病原學檢查臨床樣本顯微鏡檢查患者血液直接鏡檢取早期患者血液一滴，加蒸餾水一滴，使血細胞溶解，在暗視野顯微鏡下檢查有無活動的鉤端螺旋體。取早期患者靜脈血1mL～2mL于無菌試管中靜置凝固，離心沉淀，吸取血清與血細胞交界處略顯白色的懸液，置于載玻片上，在暗視野顯微鏡下檢查有無活動的鉤端螺旋體。采集早期患者靜脈血1mL，加于含2mL枸櫞酸鈉鹽水管中，1000r/min離心10min，吸上層血漿置另一清潔管中，3000r/min～3500r/min離心30min～60min。棄上清，取沉淀物一滴于玻片上，用暗視野顯微鏡檢查有無活動的鉤端螺旋體。患者尿液直接鏡檢無菌采集患者尿液，取一滴尿液置于載玻片上，加蓋玻片，在暗視野顯微鏡下檢查有無活動的鉤端螺旋體。細菌分離培養(yǎng)患者血液培養(yǎng)血培養(yǎng)應在發(fā)病最初10d內(nèi)并在使用抗生素治療前進行。無菌操作取患者血液100μL～200μL，接種到5mL～10mLKorthof或EMJH（Ellinghuasen-McCullough-Johnson-Harris）等適宜培養(yǎng)基中，平行接種2管～3管，在28℃培養(yǎng)，每隔5d～7d取培養(yǎng)物在暗視野顯微鏡下觀察有無一端或兩端彎曲成鉤狀、菌體呈現(xiàn)問號狀、C或S形態(tài)的螺旋體生長，若有生長，可進一步開展鑒定。若未見生長，應繼續(xù)培養(yǎng)60d，仍不見生長方作陰性處理。患者尿液培養(yǎng)采集發(fā)病1w后的患者中段尿30mL～50mL于無菌離心管中，以10000r/min離心1min。取沉渣0.5mL接種于第一管5mLKorthof或EMJH培養(yǎng)基中，混勻后吸0.5mL接種于第二管5mL培養(yǎng)基中，混勻后吸0.5mL接種于第三管5mL培養(yǎng)基中。平行接種2管～3管，在28℃培養(yǎng)，每隔5d～7d取培養(yǎng)物在暗視野顯微鏡下觀察有無一端或兩端彎曲成鉤狀、菌體呈現(xiàn)問號狀、C或S形態(tài)的螺旋體生長，若有生長，可進一步開展鑒定。若未見生長，應繼續(xù)培養(yǎng)60d，仍不見生長方作陰性處理。為提高檢出率和減少污染，可在采集尿標本的前一天晚上給患者口服碳酸氫鈉（NaHCO3）2g～4g，同時在培養(yǎng)基中加入100μg/mL～400μg/mL5－氟脲嘧啶或1/2000的磺胺嘧啶。尿液標本應在留尿2h內(nèi)完成接種。患者腦脊液培養(yǎng)腦脊液培養(yǎng)應在發(fā)病最初10d內(nèi)進行。對有腦膜刺激和其他神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者，腰椎穿刺獲取腦脊液，取0.5mL腦脊液接種于5mLKorthof或EMJH培養(yǎng)基中，平行接種2管～3管，在28℃培養(yǎng)，每隔5d～7d取培養(yǎng)物在暗視野顯微鏡下觀察有無一端或兩端彎曲成鉤狀、菌體呈現(xiàn)問號狀、C或S形態(tài)的螺旋體生長，若有生長，可進一步開展鑒定。若未見生長，應繼續(xù)培養(yǎng)60d，仍不見生長方作陰性處理。動物接種培養(yǎng)取患者血液或腦脊液0.5mL～1mL或尿液2mL接種金黃地鼠（體重20g～50g）或幼齡豚鼠（體重120g～200g）下腹兩側(cè)皮下或者腹腔，進行發(fā)病觀察，一周后取心血暗視野顯微鏡下觀察以及進行鉤端螺旋體分離。鉤端螺旋體菌株鑒定顯微鏡凝集試驗（Microscopicagglutinationtest；MAT）操作步驟待檢菌株需提前在暗視野顯微鏡下檢查，要求每400倍視野下不少于100條～200條，運動活潑并無自凝。將我國15群15型標準菌株免疫家兔獲得的診斷血清，56℃水浴滅活30min后，用生理鹽水以1∶50開始稀釋，稀釋到1∶6400。不同稀釋度各血清群診斷血清、陽性對照（相應標準菌株）及空白對照生理鹽水各取50μL加入各反應孔中。分別取待檢分離株培養(yǎng)液50μL加入上述稀釋度血清及對照中。搖勻后37℃孵育1h。取反應液及對照，放置載物玻片上暗視野顯微鏡下觀察凝集情況。凝集滴度按原血清稀釋倍數(shù)×2計算。終點凝集滴度的判定以出現(xiàn)＋＋凝集(即視野中50％鉤端螺旋體被凝集)的群血清最高稀釋度作為終點凝集滴度，確定所屬血清群。核酸檢測可疑菌株進行核酸檢測，檢出鉤端螺旋體特異性核酸可判定為鉤端螺旋體菌，見C.1和C.2。

（規(guī)范性）

鉤端螺旋體病血清學檢查標本要求需采集患者急性期和恢復期雙份血清進行檢測。急性期血清應在首次檢視患者時采取，血清分離后進行第一次抗體檢測。根據(jù)患者的病程（一般為3w～4w）獲得恢復期血清后，進行第二次抗體檢測，兩次間隔2w～3w。采用顯微鏡凝集試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗進行檢測。顯微鏡凝集試驗（MAT）抗原的選擇和制備將我國15群15型鉤端螺旋體標準菌株接種于Korthof或EMJH等適宜培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)5d～7d，暗視野顯微鏡檢查，每400倍視野下不少于100條～200條，運動活潑并無自凝者可作為抗原。操作步驟患者血清56℃水浴滅活30min后，用生理鹽水以1∶50（早期患者血清）或1∶100（恢復期患者血清）和1∶400兩個稀釋度做定性試驗。稀釋血清以及陽性對照、陰性對照及空白對照生理鹽水各取50μL加入各反應孔中。分別取15個代表株鉤端螺旋體的培養(yǎng)液50μL加入上述稀釋度血清及對照中。搖勻后37℃孵育1h。取反應液及對照，放置載物玻片上暗視野顯微鏡下觀察凝集情況。若稀釋血清與某一血清群鉤端螺旋體抗原發(fā)生凝集，需進一步稀釋該血清再與該群鉤端螺旋體抗原進行顯微鏡凝集試驗，以測定其凝集滴度，凝集滴度按原血清稀釋倍數(shù)×2計算。終點凝集滴度的判定以出現(xiàn)＋＋凝集（即視野中50％鉤端螺旋體被凝集）的血清最高稀釋度作為終點凝集滴度。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）可使用商品化試劑盒，按照操作說明書進行操作。

（規(guī)范性）

鉤端螺旋體核酸檢測聚合酶鏈式反應（PCR）檢測鉤端螺旋體特異基因目標基因從臨床標本和分離培養(yǎng)的菌株中檢測鉤端螺旋體核酸時，通常以secY和flaB作為目標基因，flaB基因用來檢測L.kirschneri致病性鉤端螺旋體，secY基因檢測其他常見的致病性鉤端螺旋體，也可選擇其他特異性基因。參考引物序列參考引物序列見表C.1。表C.1PCR用參考引物序列目標基因引物名稱序列（5'-3'）擴增片段長度（bp）secYG1CTGAATCGCTGTATAAAAGT285G2GGAAAACAAATGGTCGGAAGflaBB64-IACTAACTGAGAAACTTCTAC563B64-IITCCTTAAGTCGAACCTATGA模板制備臨床標本和已經(jīng)分離培養(yǎng)的菌株使用商品化基因組DNA提取試劑盒，具體操作方法按試劑盒說明進行。PCR反應體系一次總量25μL的反應體系如表C.2所示。表C.2PCR反應體系中的成分及加樣量試劑體積酶和緩沖液（2×）12.5μL上游引物（10μmol/L）1μL下游引物（10μmol/L）1μL待測模板（陽性對照）3μL～5μL（1μL～2μL）純水補足至25μL反應設立質(zhì)控參數(shù)：使用純水作為陰性對照，用已知鉤端螺旋體菌模板作為陽性對照。加樣順序：首先加入陰性對照，然后加待測模板，最后加入陽性對照。PCR擴增95℃預變性5min，1個循環(huán)；94℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物的檢測分析PCR產(chǎn)物各取5μL加入1%瓊脂糖凝膠的加樣孔內(nèi)（不含染料的mix需要加入1μL上樣緩沖液），加入Marker5μL，5V/cm電泳40min觀察條帶。PCR產(chǎn)物也可以進行測序分析。結(jié)果判讀在紫外透射儀或凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，當陰性對照和陽性對照成立時，如鉤端螺旋體靶基因擴增出現(xiàn)預期條帶，則表明檢測標本陽性。當陰性對照和陽性對照不成立時，需要重新進行檢測。測序結(jié)果與鉤端螺旋體菌特異基因序列匹配，表明標本陽性。實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-TimePCR）檢測鉤端螺旋體特異基因目標基因從臨床標本和分離培養(yǎng)的菌株檢測鉤端螺旋體時，以鉤端螺旋體16SrRNA基因和LipL32基因作為目標基因，也可選擇其他特異性基因。試劑選擇可使用商品化試劑盒，按照操作說明書進行操作，也可按照以下步驟進行。參考引物和探針序列16SrRNA基因和LipL32基因參考引物和探針序列見表C.3。表C.3Real-TimePCR引物和探針具體信息目標基因名稱序列16SrRNALeptoF5'-CCCGCGTCCGATTAG-3'LeptoR5'-TCCATTGTGGCCGRA/GACAC-3'LeptoP5'-(FAM)CTCACCAAGGCGACGATCGGTAGC-3'(BHQ1)LipL32lipL32-45F5'-AAGCATTACCGCTTGTGGTG-3'lipL32-286R5'-GAACTCCCATTTCAGCGATT-3'lipL32-Prob5'-VIC-AAAGCCAGGACAAGCGCCG-3'(BHQ1)模版制備同C.1.3。Real-TimePCR反應體系一次總量20μL的Real-TimePCR反應體系見表C.4。表C.4Real-TimePCR反應體系中的成分及加樣量試劑體積酶和緩沖液（2×）10μL上游引物（10μmol/L）0.4μL下游引物（10μmol/L）0.4μL探針溶液（10μmol/L）0.4μL待測模板（陽性對照）3μL～5μL（1-5μL）純水補足至20μL反應設立質(zhì)控參數(shù)：使用純水作為陰性對照，用已知鉤端螺旋體菌模板作為陽性對照。加樣順序：首先加入陰性對照，然后加待測模板，最后加入陽性對照。Real-TimePCR擴增一般使用兩步法進行擴增，參考程序如下：95℃預變性10s，1個循環(huán)；擴增反應：95℃5s，60℃40s，40個循環(huán)。不同的熒光定量PCR儀擴增