木瓜蛋白酶提取實驗方案實驗設計題目：木瓜蛋白酶的提取,純化分離及其生物學研究實驗原理：木瓜蛋白酶（papain）又稱木瓜酶，廣泛存在于番木瓜的根、莖、葉和果實，未成熟果實的乳汁中含量最豐富。是一種含疏基（-SH）肽鏈的內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有較廣泛的特異性，對動植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有較強的水解能力；同時還具有合成的功能，能把蛋白水解物合成為類蛋白質。工業用的木瓜蛋白酶一般都是未經純化的多酶體系。現已知經木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四種主要酶類：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papayaproteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapainM），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液為無色或淡黃色，有時呈乳白色；幾乎不溶于有機溶劑。它的最適pH值為5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性時亦有作用；最適溫度為55～60℃（一般10～85℃皆可），耐熱性強，在90℃時也不會完全失活；受氧化劑抑制，還原性物質激活。本實驗主要采取有機溶劑沉淀法結合硫酸銨分級沉淀法來提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。有機溶劑沉淀法：有機溶劑能降低溶液的電解常數，從而增加蛋白質分子上不同電荷的引力，導溶解度的降低，另外，有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質的水化膜，故蛋白質在一定濃度的有機溶劑中的溶解度差異而分離的方法。有機溶劑分段沉淀法它常用于蛋白質或酶的提純。使用的有機溶劑多為乙醇和丙酮。高濃度有機溶劑易引起蛋白質變性失活，操作必須在低溫下進行，并在加入有機溶劑時注意攪拌均勻以避免局部濃度過大。硫酸銨分級沉淀法：硫酸銨沉淀法可用于從大量粗制劑中濃縮和部分純化蛋白質。高濃度的鹽離子在蛋白質溶液中可與蛋白質競爭水分子，從而破壞蛋白質表面的水化膜，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來。各種蛋白質的溶解度不同，因而可利用不同濃度的鹽溶液來沉淀不同的蛋白質。這種方法稱之為鹽析。鹽析時溶液PH在木瓜蛋白酶等電點時（PI=8.75）則效果最好，鹽濃度通常用飽和度來表示。硫酸銨因其溶解度大，溫度系數小和不易使蛋白質變性而應用最廣。木瓜蛋白酶活力測定：蛋白酶在一定條件下不僅能夠水解蛋白質中的肽鍵，也能夠水解酰胺鍵和酯鍵，因此可用蛋白質或人工合成的酰胺及酯類化合物作為底物來測定蛋白酶的活力。本實驗選用酪蛋白為底物，測定微生物蛋白酶水解肽鍵的活力。酪蛋白經蛋白酶作用后，降解成相對分子質量較小的肽和氨基酸，在反應混合物中加入三氯乙酸溶液，相對分子質量較大的蛋白質和肽就沉淀下來，相對分子質量較小的肽和氨基酸仍④漿液用8層紗布進行過濾,將所得液分裝到離心管中，用離心機在3500r/min的條件下，離心15min。⑤收集上清液至一潔凈的試管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（編號為酶液1）。4.2.2粗酶液純化：將粗液放入冰桶中，加入適量酶保護劑（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混勻后如下表加入試劑。酶液+保護劑（ml）硫酸銨粉末（至終濃度20%）（g）硫酸銨粉末（至終濃度的40%）（g）酶液+保護劑（ml）冷無水乙醇（65%）（ml）酶原液370+10148.6調節ph為6.0，4℃靜置過夜酶原液470+10置于冰桶中20靜置30min，離心4000r/min，30min，棄沉淀22靜置30min，離心4000r/min，30min，取沉淀，加10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液2），-20℃保存9+118.6對過夜的酶液繼續處理酶液+保護劑（ml）硫酸銨粉末（至終濃度20%）（g）硫酸銨粉末（至終濃度40%）（ml）酶原液34℃靜置過夜4000r/mn離心30mn,取沉淀，分別加加10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液3），-20℃保存9+1置冰桶中2.5靜置30min,離心4000r/min,30min，棄沉淀2.7靜置30min,離心4000r/min,30min，取沉淀，加入10ml蒸餾水取1ml酶液（酶液4），-20℃保存透析袋處理取酶液并編號酶液6，-20℃保存酶原液4編號酶液5，-20℃保存透析袋處理取酶液并編號酶液7，-20℃保存4.2.3透析：8000-14000標號的透析袋處理：①取透析袋剪成適當長度的小段。放入大體積的2%(m/v)碳酸氫鈉和1mmol/LEDTA(pH8.0)中將透析袋煮沸10分鐘。②用蒸餾水徹底漂洗透析袋。放在1mmol/LEDTA(pH8.0)中將之煮沸10分鐘。③冷卻后，存放于4度，必須確保透析袋始終浸沒在溶液內。從此時起取用透析袋是必須戴手套，在透析袋內裝滿水然后排出，將之清洗干凈。④系好透析袋的一端，從另一端注入酶液4、5，將透析袋放入蒸餾水中，在搖床上震蕩，時時換蒸餾水。⑤直至向蒸餾水中加入氯化鋇溶液，無沉淀產生及透析除鹽完成。取出蛋白質溶液。60%乙醇60%乙醇透析膜處理40%硫酸銨45%飽和硫酸銨60%乙醇酶液1酶液3酶液4酶液2酶液5酶液6酶液7番木瓜透析膜處理4.3木瓜蛋白酶活性及總蛋白含量測定：4.3.1酶活性的測量酪氨酸標準液和酶液處理酪氨酸標準液的制備：精密稱取酪氨酸0.005g用0.1mol/L鹽酸溶解并定容至100mL。（此為50ug/ml的標準液）酶液的處理：取0.3ml酶液，加酶稀釋液2.7ml，稀釋至3mL。操作待測液：準確量取酶液溶液各1.0mL，分別置于2支10mL帶塞試管中，于50度水浴預熱5分鐘，準確加入50度預熱的酪蛋白溶液5mL，立即振搖，置50度水浴中，精確反應10min后，加三氯乙酸溶液5.0mL，振搖，于50度水浴中放置40min，用干燥濾紙過濾，濾液在2h內采用分光光度法以水為空白，在275nm的波長處測定吸光度A。空白對照液：再精確量取酶液1.0mL，置于10mL具塞試管中，于50度水浴預熱5min，準確加入50度預熱的蒸餾水5ml,置50度水浴中，加入三氯乙酸溶液5mL，振搖，于50度水浴中放置40min，用干燥濾紙過濾，濾液在2h內采用分光光度法以水為空白，在275nm的波長處測定吸光度A0。酪氨酸標準液：另取酪氨酸對照溶液，以蒸餾水為空白，在275nm的波長處測定吸光度An。酶活力單位定義為在測定條件下,每1min生成1μg/mL酪氨酸所需的酶量。公式：酶活力（U/g）=式中:Ｗ1—酪氨酸標準液每1ｍＬ中含酪氨酸的量,單位為微克(μｇ);10—反應時間;11—測定總體積;n—待測液的稀釋倍數;1000—毫克與克的轉換倍數。在上述條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1μｇ酪氨酸所需的酶量為1個酶活力單位。4.3.2酶含量的測量：取8支15mL試管，按下表加入試劑管號12345678蛋白質標準溶液（ml）00.10.20.30.40.60.81.O蒸餾水（ml）1.00.90.80.70.60.40.20考馬斯亮藍（ml）4.04.04.04.04.04.04.04.0蛋白質含量（ug）0102030406080100A595將試管搖勻，放置2-3分鐘。用分光光度計比色測定吸光值A595nm。(注意應在1小時內完成比色)，以A595nm為縱坐標，標準蛋白色質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。對酶液進行稀釋，統一酶液體積至100ml：分別取1ml