第第頁丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定試劑盒說明書丙酮酸脫羧酶（PDC）活性測定試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預期差異大的樣本做預測定。測定意義：PDC主要存在于酵母中，是乙醇發酵的關鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。測定原理：PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化NADH還原乙醛生成乙醇和NAD+；NADH在340nm有吸收峰，而NAD+沒有；通過測定340nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。自備儀器和用品：研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、可調式移液槍和蒸餾水。試劑組成和配制：試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。試劑二：液體18mL×1瓶，4℃保存。試劑三：液體2.5mL×1瓶，4℃保存。試劑四：粉劑×1支，﹣20℃保存。試劑五：液體30μL×1瓶，﹣20℃保存。混合試劑：臨用前配制，將試劑四和試劑五轉移至試劑三中充分溶解待用，用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復凍融。試劑六：液體2mL×1管，4℃保存。粗酶液提取：1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g4℃離心20min，取上清，置冰上待測。2、組織處理：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿，16000g4℃離心20min，取上清，置冰上待測。3、血清（漿）樣品：直接檢測。PDC測定操作：1.分光光度計/酶標儀預熱30min，調節波長到340nm，蒸餾水調零。2.試劑二置于25℃水浴中預熱30min。3.空白管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL蒸餾水、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A1和A2、4.測定管：依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL上清液、20μL混合試劑、140μL試劑二和20μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4、注意：空白管只需測定一次。PDC活性計算：a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下（1）按照蛋白濃度計算活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/mgprot)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣)÷T=1608×[(A3－A4)－(A1A2)]÷Cpr（2）按照樣本質量計算活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/g鮮重)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1608×[(A3－A4)－(A1A2)]÷W（3）按細胞數量計算活性單位定義：25℃中，每104個細胞每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/104cell)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T=1608×[(A3－A4)－(A1A2)]÷細胞數量（4）按血清（漿）體積計算活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/mL)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T=1608×[(A3－A4)－(A1A2)]ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V總：反應體系總體積，0.2mL=2×104L，V樣：加入反應體系中上清液體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質含量試劑盒；W：樣品質量；T：反應時間，1min。b.使用96孔板測定的計算公式如下（1）按照蛋白濃度計算活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/mgprot)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(Cpr×V樣)÷T=3215×[(A3－A4)－(A1A2)]÷Cpr（2）按照樣本質量計算活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/g鮮重)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(W×V樣÷V樣總)÷T=3215×[(A3－A4)－(A1A2)]÷W（3）按細胞數量計算活性單位定義：25℃中，每104個細胞每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/104cell)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷(細胞數量×V樣÷V樣總)÷T=3215×[(A3－A4)－(A1A2)]÷細胞數量（4）按血清（漿）體積計算活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1nmolNADH氧化為1個酶活單位。PDC(nmol/min/mL)={[(A3－A4)－(A1A2)]÷ε÷d×V總×109}÷V樣÷T=3215×[(A3－A4)－(A1A2)]ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；