中華人民共和國農業行業標準中華人民共和國農業部發布I本標準的附錄A為規范性附錄。本標準由農業部畜牧獸醫局提出并歸口。本標準起草單位：農業部獸醫診斷中心。本標準主要起草人：田克恭、王宏偉、遇秀玲、陳西釗、王傳彬。1本標準規定了犬瘟熱(CD)的臨床診斷、犬瘟熱病毒(CDV)的分離與鑒定、免疫酶試驗和免疫酶組織化學方法等診斷技術。本標準適用于犬瘟熱的診斷。2臨床診斷要點2.1臨床癥狀CD的臨床表現多種多樣，與CDV的毒力，環境條件，宿主的年齡、品種及免疫狀態有關。病犬體溫升高至40℃以上，鼻流清涕至膿性鼻汁，膿性眼屎，有咳嗽、呼吸急促等肺炎癥狀，腹下可見米粒大丘疹。病程長的犬足枕角質層增生。病后期CDV侵害大腦時則出現神經癥狀，頭、頸、四肢抽搐。2.2病理變化CDV為泛嗜性病毒，對上皮細胞有特殊的親和力，因此病變分布非常廣泛。新生幼犬感染CDV通常表現胸腺萎縮。成年犬多表現結膜炎、鼻炎、氣管支氣管炎和卡他性腸炎。表現神經癥狀的犬通常可見鼻和腳墊的皮膚角化病。中樞神經系統的大體病變包括腦膜充血，腦室擴張和因腦水腫所致的腦脊液增加。CDV的包涵體通常呈嗜酸性，位于胞漿內，直徑1μm～5μm,可在粘膜上皮細胞、網狀細胞、白細胞、神經膠質細胞和神經元中發現。核內包涵體多位于被覆上皮細胞、腺上皮細胞和神經節細胞。3病毒分離與鑒定3.1材料準備3.1.1.1改良最低要素營養液(DMEM)培養基，配方見第A.1章。3.1.1.2非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)。3.1.1.3標準陽性血清：CDV單克隆抗體，中和抗體效價1:1024。3.1.1.4標準陰性血清：無CDV感染的犬血清。3.1.1.5新生牛血清處理：用無血清DMEM洗滌細胞兩次，加入培養液二分之一量的新生牛血清，37℃吸附1h。吸附后的新生牛血清分裝，置—20℃備用。3.1.1.6青霉素、鏈霉素。3.1.2器材a)細胞培養瓶；b)吸管；c)二氧化碳培養箱；d)37℃恒溫水浴箱；e)普通冰箱及低溫冰箱；f)離心機及離心管；g)研磨器械；h)普通光學顯微鏡；2i)微量加樣器，容量5μL~50μL,50μL~200μL;j)0.45μm微孔濾膜。CDV存在于病犬心臟、肺臟、脾臟、胸腺、淋巴結等組織器官中。無菌采集這些器官用無血清DMEM制成20%組織懸液，3000r/min離心30min,取上清。10000r/min離心20min,取上清用于CDV分離。3.2操作方法3.2.1細胞培養用含8%已處理的新生牛血清的DMEM培養基，在37℃培養Vero細胞。每3d～4d傳代一次，3.2.2病料接種將0.1mL處理好的組織懸液接種Vero細胞，33℃吸附1h,加入無血清DMEM繼續培養5d~7d,觀察結果。3.2.3結果觀察CDV感染Vero細胞4d~5d表現為細胞變圓、胞漿內顆粒變性和空泡形成，隨后形成巨細胞和合胞體，并在胞漿中出現包涵體。若第一次接種未出現細胞病變，應將細胞培養物凍融后盲傳三代。如仍將出現細胞病變的細胞培養物，按第4章的方法制備細胞涂片，用CDV單克隆抗體進行鑒定。4免疫酶試驗4.1材料準備4.1.1試劑4.1.1.1磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.2章。4.1.1.2抗原涂片的制備：將CDV接種Vero細胞，接種后5d～7d,病變達50%～75%時，用胰蛋白酶消化分散感染細胞，PBS洗滌三次后，稀釋至1×10°個細胞/mL。取印有10個～40個小孔的室玻片，每孔滴加10μL。室溫自然干燥后，冷丙酮(4℃)固定10min。密封包裝，置—20℃備用。4.1.1.3標準陽性血清：CDV單克隆抗體，中和抗體效價1:1024。4.1.1.4標準陰性血清：無CDV感染的犬血清。4.1.1.5酶結合物：HRP標記的葡萄球菌A4.1.2器材a)普通光學顯微鏡；b)印有10個～40個小孔的室玻片；d)37℃恒溫培養箱或水浴箱。4.1.3樣品存或立即送檢。試驗前將被檢血清統一編號，并用PBS作10倍稀釋。4.2操作方法4.2.1取出抗原涂片，室溫干燥后，滴加10倍稀釋的待檢血清和標準陰性血清、標準陽性血清，每份血清加兩個病毒細胞孔和一個正常細胞孔，置濕盒內，37℃30min。4.2.2PBS漂洗三次，每次5min,室溫干燥。34.2.3滴加適當稀釋的酶結合物，置濕盒內，37℃30min。4.2.4PBS漂洗三次，每次5min。4.2.5將室玻片放入底物溶液中，室溫下顯色5min~10min。PBS漂洗兩次，再用蒸餾水漂洗一次。4.2.6吹干后，在普通光學顯微鏡下觀察，判定結果。4.3結果判定4.3.1在陰性血清對照、陽性血清對照成立的情況下：即陰性血清與正常細胞和病毒感染細胞反應均無色；陽性血清與正常細胞反應無色，與病毒感染細胞反應呈棕黃色至棕褐色，即可判定結果；否則應重試。4.3.2待檢血清與正常細胞和病毒感染細胞反應均呈無色，即可判為CDV抗體陰性。4.3.3待檢血清與正常細胞反應呈無色，而與病毒感染細胞反應呈棕黃色至棕褐色，即可判為CDV抗體陽性。5免疫酶組織化學法5.1材料準備a)磷酸鹽緩沖液(PBS):配制見第A.1章。b)標準陽性血清：CDV單克隆抗體，中和抗體效價1:1024。c)標準陰性血清：無CDV感染的犬血清。d)酶結合物：HRP標記的SPA。e)過氧化氫甲醇溶液：配制見第A.4章。f)鹽酸酒精溶液：配制見第A.5章。g)胰蛋白酶溶液：配制見第A.6章。h)底物溶液：配制見第A.3章。5.1.2器材a)普通光學顯微鏡；c)石蠟切片機或冷凍切片機；d)載玻片及蓋玻片；e)37℃恒溫培養箱或水浴箱。5.1.3樣品對疑似CDV的病死犬或撲殺犬，立即采集肺、脾、胸腺、淋巴結和腦等組織數小塊，置冰瓶內立即送檢。不能立即送檢者，將組織塊切成1cm×1cm左右大小，置體積分數為10%的福爾馬林溶液中固5.2操作方法5.2.1新鮮組織按常規方法制備冰凍切片。冰凍切片風干后用丙酮固定10min～15min;新鮮組織或固定組織按常規方法制備石蠟切片，常規脫蠟至PBS(切片應用白膠或鉻礬明膠做粘合劑，以防脫片)。5.2.2去內源酶；用過氧化氫甲醇溶液或鹽酸酒精溶液37℃作用20min。5.2.3胰蛋白酶消化：室溫下，用胰蛋白酶溶液消化處理2min,以便充分暴露抗原。5.2.5封閉；滴加體積分數為5%的新生牛血清或1:10稀釋的正常馬血清，37℃濕盒中作用30min。5.2.6加適當稀釋的標準陽性血清或標準陰性血清，37℃濕盒中作用1h或37℃濕盒中作用30min后4℃過夜。5.2.7漂洗同5.2.4。45.2.8加適當稀釋的酶結合物，37℃濕盒作用1h。5.2.9漂洗同5.2.4。5.2.10底物顯色：新鮮配制的底物溶液顯色5min～10min后漂洗。5.2.11襯染：蘇木素或甲基綠襯染細胞核或細胞質。5.2.12從90%乙醇開始脫水、透明、封片、普通光學顯微鏡觀察。5.2.13試驗同時設陽性對照和陰性對照。5.3結果判定陽性和陰性對照片本底清晰，背景無非特異著染，陽性對照組織細胞胞漿呈黃色至棕褐色著染，試驗成立；被檢組織細胞胞漿、偶見胞核呈黃色至棕褐色著染，即可判為CDV抗原陽性。6綜合判定當在臨床上懷疑有CDV感染時，可根據實際情況在上述方法中選一種或兩種方法進行確診。對于未接種過CDV疫苗的犬，采用任何一種方法檢測呈現陽性結果時，都可最終判定為CDV感染犬。對于接種過CDV疫苗的犬，當病毒分離鑒定試驗為陽性結果時，可最終判定為CDV感染犬；若僅血清學試驗呈現陽性結果，應結合病史和疫苗接種史進行綜合判定，不可一律視為CDV感染犬。(規范性附錄)試劑的配制A.1DMEM(高糖)培養液的配制A.1.1量取去離子水950mL,置于適宜的容器中。A.1.2將DMEM粉劑10g加于30℃的去離子水中，邊加邊攪拌。A.1.3每1000mL培養液加3.7g碳酸氫鈉。A.1.4加去離子水至1000mL,用1mol/L氫氧化鈉或鹽酸將培養液pH值調至pH6.9～7.0。在過濾之前應蓋緊容器瓶塞。A.1.5立即用孔徑0.45μm的微孔濾膜正壓過濾除菌，4℃冰箱保存備用。A.2