第第頁【電泳儀】電泳儀顯現代碼故障該怎么辦電泳儀維護和修理保養

PCR的工作機制

PCR由一系列多而雜的化學反應，包含前、中、后三個階段。緊要的化學變化是熱循環期間的產物合成。每次循環后產物、模板、聚合酶、引物和脫氧核苷酸的余量都會更改，處于連續的不穩定狀態。全部的循環都是從模板和以前產物的變性開始。當溫度較低時，引物退火到模板上。

早先若干循環的退火步驟要求引物找尋正確的染色體模板作為它們的目標。在中期的循環中，以前合成的產物優先成為模板。最后幾個循環中，增擴后的高濃度產物相互雜交，由此阻攔與引物的雜交。

引物退火后，TaqDNA聚合酶把本身定位到引物和模板綜合體上，提取介質中的自由dNTPs然后沿著模板延長。從本質上講，引物和模板的任何反應都會造成產物擴展，它們的特異性在最初的幾個循環中可能很難掌控，得到非特異性產物的摩爾量超過在模板上正確退火位置的量。PCR反應特異性的牢靠度倚靠于2個引物必需定位到互補的DNA鏈上。進一步講，退火溫度和Mg2+離子的濃度影響引物穩定的雜交到模板上，雜交位置間距應小于10kb。

相比之下，增擴階段的大部分循環里，模板被很好的與以前增擴的片段區分開。這些片段的數量取決于早先若干個循環的嚴密性。甄選同源性引物的退火位置是較簡單的，增擴期間由染色體DNA貢獻的有效的模板數量只是可以疏忽一小部分。甄選的多而雜性被超量由引物從互補位點新增擴的片段所降低。

PCR的化學計量

熱力學方面的影響對PCR來講是試劑濃度和模板間的對應關系。在起先的循環中PCR試劑的摩爾比率是最高的，隨著PCR產物的加添而降低。令人驚詫的是這種減低是由增擴的目標分子的加添引起的而不是由于試劑的消耗。最初剩余的引物和脫氧核苷酸與模板的比率是固定的，反應結束后，dNTP的濃度下降超過1倍，引物任然剩余95%，TaqDNA聚合酶沒有變化。增擴千萬倍目標分子后，模板分子遠多于酶分子。當產物加添后，酶全部被占用了，引物和模板的比率減低，推動自身退火。當自身退火的數量加添或酶的總量有限時，反應處于飽狀態并停止指數級的增長。增擴階段是自我受限的。這個階段之后，熱循環轉向未在最初幾個循環中被選擇的誑騙性的目標增擴，盡管能夠通過提高開始時TaqDNA聚合酶和引物的含量來維持高試劑比率，但這種修改很可能引起丟失特異性由于引物會胡亂雜交，顯現額外的條帶和斑點。

熱啟動（hotstart）PCR

用于引物設計的位點由于遺傳元件的定位而受限時，如site—directed突變、表達克隆或用于DNA工程的遺傳元件的構建和操作，熱啟動PCR對提高PCR特異性尤為有效。盡管TaqDNA聚合酶的較佳延長溫度在72℃，聚合酶在室溫仍舊有活性。因此，在PCR配制過程中，熱循環剛開始，以及保溫溫度低于退火溫度時會產生非特異性的產物。這些非特異性產物一旦形成，就會被有效擴增。

限制TaqDNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反應液，并將其置于預熱的PCR儀。這種方法簡單便宜，但并不能完成抑制酶的活性，無法完全除去非特異性產物的擴增。熱啟動通過抑制DNA合成，直到PCR儀達到變性溫度。方法包括延緩加入TaqDNA聚合酶，在反應體系達到90度時，短時間停止并保持溫度在70度以上。手工加入聚合酶，這個方法過于繁瑣，尤其是對高通量應用簡單造成污染。其他的熱啟動方法使用蠟防護層將一種基本成分如鎂離子、酶、模板、緩沖液包裹起來，物理地分隔開。熱循環開始后，因蠟熔化而把各種成分釋放出來并混合在一起。蠟防護層法與手動熱啟動法一樣比較繁瑣，易受污染，不適用于高通量應用。

還有一種方法是使用inactiveDNAPolymerase.polymerase被抗體抑制失活，當變性溫度超過70度時，抗體也變性了，這樣polymerase又被激活了。

BoosterPCR

整個PCR反應過程中引物前后擔負2種功能，篩選探針和增擴引導。在最初的幾個熱循環期間，每個引物作為探針獨立地活動，篩選全部目標。假如一對引物與目標雜交，方向和位置都正確，就意味著目標選擇的工作完成了。接下來在以后的循環中這對引物引導增擴反應。

增擴低濃度的模板（等于或小于100個模板）比如單個細胞，石蠟化的組織有不同的特點。篩選階段相對于模板而言要有更多剩余的試劑。稀釋的模板造成難以篩選，由于引物和模板相遇和頻率被大大的降低了。這種情況更有可能引起引物之間形成二聚體。BoosterPCR是解決這個問題的方法。在此步驟中，第一個循環階段使用稀釋后的引物和模板取得固定的引物/模板比例，大約在107:1、以確保開始擴增時的精準性，在增擴階段提高引物的濃度到正常水品。

嵌套的引物

假如增擴出的DNA序列嵌套存在于引物退火位置之間，從大范圍看增擴出的目標是同源的。引物雜交的嚴密性在最初若干個循環里是寬松的，允許較高的錯配偏差。這個效果能通過低于計算得到引物退火溫度來達到。第二步選擇明確的產物，嚴謹地選擇一條已知染色體片段用來增擴。簡單點說就是設計兩對引物,一對是長的，另一對短的是包含在長引物內的，用長引物擴增的產物作為第二次擴增的模板，這樣可以加添產物的量而且可以削減非特異性帶和錯配的情況.

假陰性

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量，④PCR循環條件。找尋原因亦應針對上述環節進行分析討論。

模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不顯現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩定的消化處理液，其程序亦應固定不宜任意更改。

酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否由于酶的活性失去或不夠而導致假陰性。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠。

引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、簡單彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要重視引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，確定要有引物條帶顯現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

假陽性

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，簡單顯現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應當心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內或濺出離心管外。②除了酶及其他不耐高溫的物質外，全部試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及進樣槍頭均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有確定的同源性。可相互拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或除去。

顯現非特異性擴增帶

PCR擴增后顯現的條帶與估量的大小不一致，或大或小，或者同時顯現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的顯現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次，是酶的質和量，往往一些來源的酶易顯現非特異條帶而另一來源的酶則不顯現，酶的量過多有時也會顯現非特異性擴增。其對策有：①必要時，重新設計引物。②減低酶的量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當加添模板量，削減循環次數。④適當提高退火溫度或接受二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延長，也叫兩步法）。

顯現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時顯現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶的量過大或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①削減酶的量，或調換另一來源的酶。②削減dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④加添模板量，削減循環次數電泳儀六大常見問題處理方案

電泳儀是專為進行電泳供應外加電場的直流電源，其輸出電壓或電流或功率要求相對穩定或按特定規律變化。

常見問題一：電泳儀的輸出為何達不到設定值？

①電泳儀的輸出狀態遵守“歐姆定律”：電壓U=電流I×（電泳槽）電阻R相對不變的情況下，U、I、P（功率P=電流I×電壓U）中任意一個參數恒定，其他參數也隨之恒定；而任意一個參數變化，其他參數也隨之正比變化；

②假如電泳儀的輸出電壓U達不到預置值，應首先察看I或P是否已經恒定，或者已經達到電泳儀所規定的最大I或P（JY電泳儀均有明確指示燈標志）。假如尚未達到極限值，將已經恒定I或P的設置調大（有必要的話至極限值），才能夠提高電壓輸出；

③假如電泳儀的電流I達不到預置值，可調整電壓U或功率P；

④假如電泳儀的功率P達不到預置值，可調整電壓U或電流I。

常見問題二：電腦掌控電泳儀發生過壓報警現象，怎么辦？

①檢查是否空載使用；

②是否電泳槽未加緩沖液；

③是否電泳槽鉑金絲斷。

常見問題