關(guān)于蛋白質(zhì)多肽類藥物傳遞的研究進(jìn)展

人類基因組計(jì)劃(HumanGenomeProject)

1990.10----2003.3美國,英國,法國,德國,中國,日本

完成人類基因組DNA的30億個(gè)堿基對(bases)的測序中國承擔(dān)1%人類基因測序任務(wù)(“中國卷”)

人類第一次在分子水平上全面地認(rèn)識自我第2頁,共74頁，2024年2月25日，星期天人類生命科學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)嶄新的時(shí)代---------

后基因組時(shí)代(post-genomeera)第3頁,共74頁，2024年2月25日，星期天二十一世紀(jì)的生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)l(fā)生革命性的變化以蛋白質(zhì)/肽為基礎(chǔ)的創(chuàng)新藥物------------基因治療藥物基因工程藥物基因工程疫苗(genevaccine,DNAvaccine)反義寡核酸藥物將被迅速地研究開發(fā)第4頁,共74頁，2024年2月25日，星期天FDA已批準(zhǔn)>417個(gè)protein/peptide藥物/疫苗

干擾素Interferon

白細(xì)胞介素Interleukin-2

生長因子KGF

集落刺激因子GM-CSF

凝血因子BeneFIX

重組胰島素Humulin

重組人生長激素

rhFSH

單克隆抗體Zenapax

多克隆抗體Thymoglobulin基因工程藥物的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)或肽第5頁,共74頁，2024年2月25日，星期天蛋白質(zhì)和肽ProteinandPeptide第6頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ProteinsandPeptide蛋白質(zhì)和肽Polypeptidescomposedofcovalentlylinkedaminoacids肽由氨基酸以共價(jià)鍵結(jié)合而成

Polypeptideswith<40aminoacidsarecalledpeptides

<40個(gè)氨基酸：

肽（多肽）Polypeptideswith>40aminoacidsarecalledproteins

>40個(gè)氨基酸：蛋白質(zhì)

Functionofaproteindeterminedbyitsnon-covalent3Dstructure蛋白質(zhì)的功能：三維結(jié)構(gòu)第7頁,共74頁，2024年2月25日，星期天AminoAcids氨基羧基側(cè)鏈第8頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Polypeptides<40aminoacid肽鍵

肽鍵第9頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ProteinStructureFoldβ

Mixedα/βHelixαα/β混合型β折疊型免疫球蛋白螺旋型血紅蛋白第10頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ClassesofProtein/PolypeptidePharmacueticalsVaccines疫苗

(peptides,partsofproteins,killedbacteria,etc.)Polypeptides多肽

(oxytocin腦垂體激素,pitocin催產(chǎn)素)Bloodproducts(FactorX,FactorVIII凝血因子,基因療治血友病,

gammaglobulin,serumalbumin)Recombinanttherapeuticproteins

重組治療蛋白質(zhì)(herceptin單克隆抗體,humulin重組胰島素,

alferon干擾素,etc.)蛋白質(zhì)/多肽類藥物分類第11頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Vaccines疫苗Diptheria白喉?xiàng)U菌

(Corynebacteriumdiphtheriae)-diptheriatoxinTetanus破傷風(fēng)(Clostridiumtetani)-tetanustoxinWhoopingcough百日咳(Bordetellapertussis,)-acullelarextractTetanusToxin破傷風(fēng)毒素片段

β折疊型

第12頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TherapeuticProtein/PeptideInsulin(diabetes)胰島素(糖尿病51aminoacid)Interferonb干擾素b(relapsingMS,多發(fā)性硬化癥)Interferong干擾素g(granulomatous,肉芽瘤)TPA組織多肽抗原Activase(heartattack,心臟病發(fā)作)第13頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TherapeuticProtein/PeptideActimmune(Ifg干擾素)Activase(TPA,組織多肽抗原)BeneFix(FIX,凝血因子IX,血友病B型治療)Betaseron(Ifb,干擾素,多發(fā)性硬化癥緩和期,復(fù)發(fā)期)Humulin重組胰島素Novolin重組胰島素Regranex(PDGF,血小板衍生生長因子)Novoseven(FVIIa重組凝血因子)Epogen紅細(xì)胞生成素Intron-A(干擾素,毛細(xì)胞白血病,生殖器疣,乙肝,丙肝,AIDS)Neupogen白細(xì)胞介素Pulmozyme重組脫氧核糖核酸酶Infergen干擾素,慢性丙肝第14頁,共74頁，2024年2月25日，星期天WhatisGeneDelivery?

什么是基因傳遞?TodeliverDNAplasmid傳遞質(zhì)粒

intocellstoarisetherapeuticeffectssuchasinduction誘導(dǎo)

enhancement促進(jìn)（抗體的生成）orblockingofproteinexpression阻礙蛋白質(zhì)基因表達(dá)（阻斷復(fù)制）第15頁,共74頁，2024年2月25日，星期天WhyisaGeneCarrierEssentialforGeneDelivery?

為什么基因載體對基因傳遞是重要的?DNAitselfcannotdiffuse擴(kuò)散

throughcellmembranebecauseofitsnegativecharge負(fù)電荷

cellmembranealsohasnegativechargeNaked無保護(hù)的

DNAisrapidlydegradedbyDNaseinbloodorcellularlysosome血或細(xì)胞中的溶酶體第16頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TheProblemwithProtein/peptide蛋白質(zhì)/肽存在的問題第17頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TheProblemwithProtein/peptide(1)

(invivo-inthebody)Verylargeandunstablemolecules分子大,不穩(wěn)定Easilydestroyed

破壞/eliminated消除

bythebodyEasilydestroyed破壞

byrelativelymildstorageconditions不嚴(yán)格的儲藏條件Hardtoobtaininlargequantities大量制備困難第18頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TheProblemwithProtein/Peptide(2)

(invivo-inthebody)Elimination消除byBandTcellsProteolysis蛋白質(zhì)水介

byendo/exopeptidases肽酶Smallproteins(<30kD)filteredoutbythekidneys腎

veryquicklyUnwantedallergicreactions過敏反應(yīng)

maydevelop(eventoxicity)第19頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第20頁,共74頁，2024年2月25日，星期天TheProblemwithProtein/Peptide(3)

(invitro-inthebottle

瓶子

)Denaturation

變性Aggregation聚合Precipitation

沉淀Adsorption吸附Deamidation脫酰胺Oxidation

氧化Disulfideexchange二硫化物交換Proteolysis蛋白質(zhì)水介Noncovalent非共價(jià)的

Covalent共價(jià)的第21頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Protein/PeptideNewFormulationProteinsequence

序列

modification(sitedirectedmutagenisis誘變)解決穩(wěn)定性問題PEGylationPEG化延長T1/2Proteinylation蛋白質(zhì)化延長T1/2

靶向Microsphere微球

/Nanosphereencapsulation微囊Micelles膠束控制釋放靶向Formulatingwithpermeabilizers滲透劑提高生物利用度新型蛋白質(zhì)/肽類藥物與制劑的研發(fā)第22頁,共74頁，2024年2月25日，星期天SiteDirectedMutagenesis誘變Allowsaminoacidsubstitutions氨基酸取代

atspecificsitesinaproteinProteinengineering蛋白質(zhì)工程

(size,shape,etc.)第23頁,共74頁，2024年2月25日，星期天SiteDirectedMutagenesis誘變E343H亞鐵螯合酶

在特殊部位用半胱氨酸取代(置換)形成二硫化物提高穩(wěn)定性第24頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PEGylationPEG化PEGisanon-toxic,hydrophilic親水性FDAapproved,unchargedpolymer沒有負(fù)荷的聚合物Increasesinvivohalflife(4-400X)肺遞釋PEG–GCSF(粒細(xì)胞集落刺激因子：化療，血液病)生物利用度3.0%→11.5%Decreasesimmunogenicity降低免疫性Increasesproteaseresistance增加對蛋白酶的抵抗Increasessolubility&stability提高溶解度和穩(wěn)定性聚乙二醇(PEG)分子中一個(gè)或多個(gè)分子與蛋白質(zhì)或肽發(fā)生化學(xué)結(jié)合第25頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Peptide-PEGmonomers單體PeptidePEGHydrophobicblock親脂性區(qū)Hydrophilicblock親水性區(qū)CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH||||||||||OHOHOHOHOHOHOHOHOHOH聚乙二醇(PEG)分子中一個(gè)或多個(gè)分子與蛋白質(zhì)或肽發(fā)生化學(xué)結(jié)合→長循環(huán)第26頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PEGylation(PEG化)+CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH-CH||||||||||OHOHOHOHOHOHOHOHOHOH聚乙二醇(PEG)分子中一個(gè)或多個(gè)分子與蛋白質(zhì)或肽發(fā)生化學(xué)結(jié)合→長循環(huán)Mixedα/β第27頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

Pulmonary

DeliveryPEG-GCSFCompoundBioavailabilityGCSF(18.8kDa)3.0%PEG-G-CSF(81.5kDa)11.5%PEG-G-CSF(146.8kDa)3.4%

PEG-GCSF粒細(xì)胞集落刺激因子

肺部傳遞第28頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PEGBiopharmaceuticalsADAGENONCASPARPEG-INTRON干擾素PEGASYS干擾素

NEULASTPEGVISOMANTMACUGENCDP870CDP860CERA第29頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Proteinylation蛋白質(zhì)化Attachment配置

ofadditionalorsecondary(nonimmunogenic不會產(chǎn)生免疫性的)proteinforinvivoprotection

體內(nèi)保護(hù)increasesinvivohalflife(10X)

延長T1/2Cross-linkingwithSerumAlbumin血清白蛋白Cross-linkingorconnectingbyproteinengineering蛋白質(zhì)工程

withantibodyfragments抗體片段第30頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Proteinylation蛋白質(zhì)化+ProteinDrugScFv(antibody)主動靶向第31頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PeptideSynthesis激活未保護(hù)的肽肽鍵第32頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MicrosphereEncapsulation微囊

提高穩(wěn)定性控制釋放速度第33頁,共74頁，2024年2月25日，星期天EncapsulationProcessinvolvesencapsulatingprotein蛋白質(zhì)

orpeptide肽

drugsinsmallporousparticles多孔性粒子forprotectionfrom“insults”避免損害andforsustainedrelease緩釋TwotypesofmicrospheresNonbiodegradable非生物可降介Biodegradable生物可降介

PLGA(polylactic-co-glycolicacid)第34頁,共74頁，2024年2月25日，星期天MicrosphereRelease微球的釋放Hydrophilic親水

(i.e.gelatin)bestforburstrelease爆破釋放Hydrophobic疏水

(i.e.PLGA)goodsustainedrelease(esp.vaccines)緩慢釋放tendstodenatureproteins變性蛋白質(zhì)Hybrid混雜

(amphipathic兩性分子)goodsustainedrelease緩慢釋放

keepsproteinsnative/active保持天然活性第35頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PeptideMicelles(膠束)

離子型聚合物膠體給藥體系15—50nm載體材料:水溶性A端:PEG鏈B端:離子型鏈(聚甲基丙烯酸等)靜電吸附,氫鍵與藥物結(jié)合成疏水內(nèi)核,水中形成納米膠束能最大程度地保持蛋白質(zhì)/肽的生物活性第36頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PeptideMicelles10–50nm第37頁,共74頁，2024年2月25日，星期天NanoparticlesforVaccine納米疫苗

DeliverywithinDendriticCells樹突狀細(xì)胞DendriticCells(ＤＣs樹突狀細(xì)胞)‘sentries’ ofthebody

機(jī)體的“崗哨”，體內(nèi)功能最強(qiáng)的“抗原提呈細(xì)胞”Eatpathogens捕捉病原體

andpresent theirantigenstoTcells激發(fā)有抗原受體的T細(xì)胞Secretecytokines分泌細(xì)胞因子

todirect immuneresponses產(chǎn)生免疫應(yīng)答第38頁,共74頁，2024年2月25日，星期天NanoparticlesforVaccine納米疫苗Mimicpathogenssurfacecharacteristics納米粒模仿病原體表面性質(zhì)AntigenforcontrolleddeliverywithinDendriticCells被吞噬進(jìn)入樹突狀細(xì)胞中，在樹突狀細(xì)胞中控制釋放“抗原”SelectiveactivationofcytokinegenesinDendriticCells選擇性激活細(xì)胞因子基因，產(chǎn)生免疫應(yīng)答ApplicationsinTherapeuticVaccines(Cancer,AIDS,HBV,HCV治療疫苗:腫瘤,艾滋,乙肝,丙肝

)第39頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PolymericNanoparticleUptakebyHumanDCs:ConfocalImage共焦圖像第40頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Protein/PeptideDrugDeliveryParenteral(injection)非胃腸道Pulmonary肺部Oralornasaldelivery口或鼻腔Patchortransdermalroute皮膚OtherroutesRectal/Vaginal直腸/陰

道Ocular眼睛蛋白質(zhì)/肽類藥物傳遞的新途徑(1)第41頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ParenteralDeliveryIntravenousIntramuscularSubcutaneousRouteofdeliveryfor95%ofprotein/peptide第42頁,共74頁，2024年2月25日，星期天由兩個(gè)二硫鍵連接的A鏈(21)和B鏈(30)共51個(gè)氨基酸組成第43頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第44頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第45頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第47頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Protein/PeptideDrugDelivery蛋白質(zhì)/肽類藥物傳遞的新途徑(2)

Parenteral(injection)非胃腸道

Pulmonary肺部Oralornasaldelivery口或鼻腔Patchortransdermalroute皮膚OtherroutesRectal/Vaginal直腸/陰

道Ocular眼睛第48頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Pulmonary

100M2

肺血流量500ml/min第49頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ExuberaInsulinDeliverySystem吸入

NektarTherapeutics/Pfizer/AventisCo.InsulinMW570051個(gè)氨基酸組成Inhaledshort–actinginsulinTreatmentoftype1andtype2diabetes糖尿病第50頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ExuberaInsulinDeliverySystemFDA

2006.1.26.批準(zhǔn)上市基因重組人胰島素干粉

?2—3μmTmax:吸入49分鐘(30—90分鐘)

注射105分鐘(60—240分鐘)BA:10%----20%第51頁,共74頁，2024年2月25日，星期天ExuberaInsulinDeliverySystem第52頁,共74頁，2024年2月25日，星期天液體氣霧劑液滴?2–3μm激光孔噴嘴第53頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

含賦料微粒?5—30μm氣流動力學(xué)?1—5μm第54頁,共74頁，2024年2月25日，星期天第55頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PulmonaryInsulinDeliverySystem

電子控制液體霧化液滴?2–3μm第56頁,共74頁，2024年2月25日，星期天Protein/PeptideDrugDeliveryParenteral(injection)Pulmonary

OralornasaldeliveryPatchortransdermalrouteOtherroutesRectal/VaginalOcular蛋白質(zhì)/肽類藥物傳遞的新途徑(3)第57頁,共74頁，2024年2月25日，星期天OralInsulin(Oralin)口腔噴霧劑BucchalaerosoldeliverysystemdevelopedbyGenerexInsulin胰島素

isabsorbedthroughthintissuelayersinmouthandthroatInsulinisformulatedwithavarietyofadditives促透劑

andstabilizers穩(wěn)定劑

topreventdenaturation防止變性onaerosolizationandtostabilizeaerosolparticles第58頁,共74頁，2024年2月25日，星期天OralInsulin(Oralin)口腔粘膜吸收Cmax30′Css120′Cmin240′BA8%起效快于皮下注射關(guān)注對口腔頰粘膜的刺激性？研發(fā)階段(美,加)國內(nèi)1996-2005年

噴舌下第59頁,共74頁，2024年2月25日，星期天pHSensitiveMicrospheres

Gel/Microspheresystemwithpolymethacrylicacid+PEG(聚甲基丙烯酸+PEG)Instomach(pH2)poresinthepolymershrink收縮，不釋放

andpreventproteinrelease避免胃酸破壞InneutralpH(foundinintestine)theporesswell膨張

andreleaseprotein結(jié)腸釋放含胰蛋白酶抑制劑pH敏感型微球第60頁,共74頁，2024年2月25日，星期天OralDeliverybyMicrospherepH2 pH7第61頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PatchDelivery第62頁,共74頁，2024年2月25日，星期天PatchDelivery

BA<1%第63頁,共74頁，2024年2月25日，星期天

NasalSpray

鼻腔長度:12–15cm總表面積:150cm2毛細(xì)血管豐富吸收迅速使用方便依從性好生物利用度高降鈣素(micacalcinnasalspray）已獲美國FDA批準(zhǔn)上市。BA3%.第64頁,共74頁，2024年2月25日，星期天OsteogenicGrowthPeptid(OGP)

NasalSpray

成骨生長肽鼻腔給藥系統(tǒng)