關于細胞工程動物染色體工程ChromosomesandInheritanceSincegenesarecarriedonchromosomes,knowledgeofchromosomenumberandstructurehasfar-reachingimplicationsforbasicgenetics,humanhealth,andevolution.Anormalhumanmalekaryotype.第2頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Chromosomestructure第3頁,共69頁，2024年2月25日，星期天ChangesinChromosomeNumberandStructureChangesinchromosomenumberandstructureareimportantforhealthandevolution.Downsyndromeiscausedbyachangeinchromosomenumber.第4頁,共69頁，2024年2月25日，星期天染色體變異染色體數變異一種是體細胞內以染色體組為基數進行的整倍性變化，這產生的變異導致多倍體或單倍體；另一種是染色體組內的個別染色體數目有所增減，使細胞內的染色體數目不是基數的的完整倍數，因此被稱為非整倍體。第5頁,共69頁，2024年2月25日，星期天染色體變異染色體結構變異染色體易位：一個染色體上某一區段與另一非同源染色體上的區段發生互換。染色體缺失：染色體的某一區段及其帶有的基因一起丟失染色體倒位：染色體上某一區段連同它帶有的基因順序發生180度倒轉。染色體復制：一個染色體上增加了相同的某個區段。第6頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Thereare4typesofchromosomestructuralchange–allofthemassociatedwithhumandisordersChromosomeStructuralChanges易位缺失倒位復制第7頁,共69頁，2024年2月25日，星期天什么是染色體工程？定義：是指人們按照預先的設計，消減、添加或替換同種或異種動物細胞染色體的技術。Rich和Khush于1966年最先提出這一概念。第8頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第一節多倍體誘導（polyploidyinduction）第二節雌核發育（gynogenesis）雄核發育（androgenesis）性別控制（sexcontrol）第三節染色體片段轉移

(transferofchromosomefragment)染色體特定位點重組

(region-specificrecombinationofchromosome)

第9頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第一節動物多倍體誘導多倍體（polyploid）Winkler(1916年)首先使用的，它是指體細胞中含有三個或更多染色體組的個體。在高等植物中相當多，但動物中卻少得多。60年代發現一種美洲角蛙是四倍體動物，之后陸續在低等脊椎動物中發現許多多倍體動物。銀鯽第10頁,共69頁，2024年2月25日，星期天多倍體第11頁,共69頁，2024年2月25日，星期天由于多倍體動物生長速度快，成活率高及抗病能力強等特點，所以人工誘導多倍體、改善動物經濟性狀倍受重視。魚類和貝類都是重要的水產養殖動物，多為體外產卵、體外受精和體外發育，因而人工誘導多倍體的研究在魚類和貝類已取得很大進展。三倍體太平洋牡蠣第12頁,共69頁，2024年2月25日，星期天(一)人工誘導多倍體的機制人工誘導染色體加倍主要有抑制受精卵第二極體排放(三倍體)或抑制受精卵的第一次卵裂(四倍體)抑制第一極體的排放-很少采用，魚類不成功，貝類畸形率高。第13頁,共69頁，2024年2月25日，星期天1stpolarbody2ndpolarbody第14頁,共69頁，2024年2月25日，星期天精子入卵時卵子所處的時相是不同的貽貝、玻璃海鞘和毛翼蟲等。大多數脊椎動物和文昌魚等如海濱蛤、海綿、蛔蟲、沙蠶如海膽和腔腸動物第15頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三倍體誘導第16頁,共69頁，2024年2月25日，星期天(二)人工誘導多倍體的方法1、生物學方法

主要采用雜交方法，尤其是種間雜交的方法。雌性草魚2n=48與雄性三角魴2n=48雜交獲得子一代染色體數目為72的草魴雜種三倍體，其中草魚提供了二倍數目的染色體48，三角魴提供了單倍數目的染色體24。為什么種間雜交會導致草魚第二極體不排出，從而導致多倍體產生？第17頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、物理學方法⑴溫度休克法

冷休克法0-5℃

熱休克法30℃左右必須要優化的三個因素：處理時刻（即處理開始時間，一般從受精開始算起）、處理持續時間和處理溫度。一般說來，冷水性魚類采用熱休克，而溫水性魚類如鯉科和鯛科魚類采用冷休克效果好。第18頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、物理學方法⑵靜水壓法

較高的水靜壓650kg/cm2，誘導率高90-100%，時間短3~5min，損傷小，成活率高。需要專門設備如水壓機，成本高；樣品室容量有限，不適于大規模生產。⑶高鹽高堿法

高pH值或高鹽的條件，尚待完善。

第19頁,共69頁，2024年2月25日，星期天3、化學方法秋水仙堿(colchicine)：可以抑制細胞分裂中紡綞絲的形成，因而抑制有絲分裂。細胞松弛素(cytochalasinB)：能抑制肌動蛋白聚合成微絲，從而抑制細胞質分裂。聚乙二醇(polyethyleneglycol)其他如麻醉劑(N2O和CHClF2)藥品有毒性，且多嵌合體，很少被使用。

第20頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（三）多倍體倍性鑒定原因：所處理的受精卵不能百分之百地成為多倍體，且常表現為嵌合體。直接方法：染色體計數和DNA含量測定等。間接方法：核體積測量法(細胞核大小與染色體數目成正比)、蛋白質電泳、生化分析和形態學檢查等。第21頁,共69頁，2024年2月25日，星期天染色體計數：準確、直接的方法。DNA含量測定：流式細胞儀。核體積測量：二倍體/三倍體核體積之比為1:1.5，二倍體與四倍體的核體積之比為1:1.74。蛋白質電泳：生化分析：如在關東系銀鯽中，三倍體紅血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍體。第22頁,共69頁，2024年2月25日，星期天多倍體動物的生活力及生長能力。許多誘導的多倍體動物如兩棲類、魚類、貝類等都具有良好的生存力和生長率。誘導三倍體可以增加種間雜種的成活率，三倍體種間雜種可以比二倍體雜種成活得更好一些。（四）多倍體動物的應用前景第23頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三倍體的優勢三倍體性腺不育：不需要消耗能量用于性腺的發育，避免了繁殖季節的肉質下降、生長停滯和死亡率增高，縮短了養殖周期，降低了養殖成本。利用三倍體的不育性來控制養殖密度，防止品種混雜和退化。第24頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三倍體的缺點三倍體的高度不育不利于種質保存，每次都需重新誘導。培育四倍體，性成熟后與二倍體雜交，獲得不育的三倍體種苗，是當前的熱門課題。第25頁,共69頁，2024年2月25日，星期天多倍體動物的其它經濟性狀三倍體虹鱒的魚肉質量確實優于二倍體，其抗傳染性造血器官壞死病毒能力較強；三倍體大西洋鮭耐低氧，故可適用于低氧環境養殖；三倍體香魚對聲音和光線的感受能力比二倍體香魚略顯遲鈍，適于在噪音較大的環境中放養。第26頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第二節雌、雄核發育和性別控制意義：產生單性種群，在純系建立、性別控制、遺傳機制研究等方面具有重要的理論和實際意義。（一）雌核發育(Gynogenesis)定義俗稱假受精，指精子雖然正常地進入卵內，激動卵子，但其細胞核并未參與胚胎發育，而是很快消失，胚胎發育僅在母體遺傳的控制下進行，因而雌核發育個體完全表現母本性狀，其基因型也與母本相同。第27頁,共69頁，2024年2月25日，星期天雌核發育不同于孤雌生殖它需要同種或異種精子進入卵子，來啟動胚胎發育。同型雌性配子，后代都是雌性個體，異型雌性配子，后代雌性雄性都有。蜜蜂進行孤雌生殖產生的單倍體卵發育成雄蜂，二倍體受精卵發育成雌蜂。第28頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（二）人工誘導雌核發育可分為兩步：雌核發育的誘導雌核發育卵子的二倍體化

第29頁,共69頁，2024年2月25日，星期天1、雌核發育的誘導即采用生物、物理或化學的方法使精子的遺傳物質失活，然后用失活精子與卵子受精，啟動卵子的雌核發育。精子雖然入卵，但并不會和雌原核融合，精原核最終降解消失，不參與胚胎發育，只起啟動卵子胚胎發育的作用。第30頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共69頁，2024年2月25日，星期天生物學方法：遠緣精子受精，不與卵原核融合。異種精子可能提供中心粒物理學方法：

-射線、

-射線或紫外線照射精子，使DNA分子形成胸腺嘧啶二聚體。玻璃針刺激魚卵或用弱電流來處理魚卵。化學方法：甲基硫酸乙烷（EMS）、咔碇黃、噻嗪、乙烯脲等處理精子。第32頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、雌核發育卵子的二倍體化含有單倍染色體組的受精卵，胚胎不能正常發育--單倍體綜合癥。必須使雌核發育的卵子染色體二倍體化，才能使胚胎正常發育。誘導染色體加倍的方法和多倍體誘導相同：一是抑制第二極體的排放，二是抑制第一次卵裂。

第33頁,共69頁，2024年2月25日，星期天（三）雌核發育的鑒別1、染色體數目和染色體組型分析法--準確2、遺傳標記法--標記基因和著絲粒的距離3、表型特征鑒別法第34頁,共69頁，2024年2月25日，星期天“中科三號”利用銀鯽雙重-雌核和有性生殖方式，從高體型(D系)異育銀鯽(♀)與平背型(A系)異育銀鯽(♂)交配所產后代中選育出來，再經異精雌核生殖培育而來的異育銀鯽新品種。第35頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、雄核發育androgenesis定義：是指卵子經過射線照射等處理，使其遺傳失活，再與正常精子受精，然后采用適當的方法使精子的染色體加倍為二倍體，發育成完全父本性狀的純合個體。意義：純合體，在遺傳育種中具有重要的理論和實際意義，種質保存。研究較少第36頁,共69頁，2024年2月25日，星期天三、動物的性別控制定義：是指通過人為地干預或操作，使動物按照人們的設計繁殖出所需性別后代的技術。動物性別控制在畜牧業、家禽養殖業、水產養殖業和養蠶業等方面都有重要的經濟意義。第37頁,共69頁，2024年2月25日，星期天(一)性別決定的遺傳類型1雄性異配子型XY型和XO型2雌性異配子型ZW型和ZO型3雄性單倍體型如蜜蜂4內在環境決定型如蚯蚓、玉米和蘋果等。5外在環境決定型如蝌蚪

20℃，雌雄各半；30℃，全雄。染色體組成不變。第38頁,共69頁，2024年2月25日，星期天(二)家畜性別控制的途徑1.X、Y精子分離技術2.胚胎性別鑒定技術3.控制受精條件

調節陰道的酸堿度。

偏酸

雌性；偏堿

雄性。

在精液中加入激素或睪丸、胎盤、腦垂體等組織的抽提物。第39頁,共69頁，2024年2月25日，星期天(三)魚類、兩棲類和爬行類的性別控制途徑控制發育條件性反轉人工雌核和雄核發育種間雜交三倍體不育第40頁,共69頁，2024年2月25日，星期天1、控制發育條件發育溫度蝌蚪性別。鱷魚：無性染色體。30℃,全雌；34℃以上,全雄；32℃,雌/雄之比為1:5；大于36℃，低于26℃下,胚胎死亡。第41頁,共69頁，2024年2月25日，星期天產卵地點揚子鱷：潮濕陰暗處，較多雌體；陽光暴曬處，較多雄體。1、控制發育條件第42頁,共69頁，2024年2月25日，星期天2、性反轉魚類：投喂雌激素或雄激素，性別改變。但染色體沒有改變。

將性反轉法和交配技術以及雌核發育技術結合起來培育全雌或全雄魚。第43頁,共69頁，2024年2月25日，星期天一、染色體片段轉移技術定義：指通過顯微注射法將外源染色體片段注入受體胚胎中，獲得轉染色體動物(Transomics)的技術。方法：顯微切割特定的染色體片段，然后注入受體動物受精卵中，并可在受體動物中表達該染色體片段的性狀。不完全雌核發育也可以將外源染色體片段導入受體動物體內。不需經基因重組構建載體可轉移超大型外源DNA。

第三節染色體片段轉移和特定位點重組技術第44頁,共69頁，2024年2月25日，星期天二、染色體特定位點重組技術能夠在特定位點誘發染色體的各種重排。該技術與小鼠胚胎干細胞技術以及基因打靶技術相結合，成為染色體工程中的一個新的亮點。第45頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第46頁,共69頁，2024年2月25日，星期天構建含有一段同源序列（與靶基因）的載體。neor基因：新霉素抗性基因，正選擇作用，同源序列內部。HSV-tk基因：皰疹病毒胸苷激酶，負選擇作用，同源序列之外。5’3’neorHSV-tk同源序列同源序列同源重組第47頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第48頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Positive-negative-selection

正負雙向選擇

應用G418正向選擇發生重組事件后將neo’基因導入基因組的ES細胞;反向選擇是根據同源重組發生時，載體末端的HSV-tk基因將被去除，在Ganciclovir存在時能存活，相反隨機整合者，由于HSV一tk的存在而被Ganciclovir殺死，從而起到很高效的選擇作用，富集了同源重組這一小概率事件，使基因打靶操作更為有效。第49頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第50頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第51頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Cre-loxP重組系統

Cre-loxPrecombinationsystem）Cre重組酶來源于P1噬菌體。作用特點：

在大腸桿菌體內或體外，都能啟動DNA分子間或分子內的聯合與重組；

重組發生在一個被稱為loxP的特異位點，且不需要其他的蛋白質因子。

在Cre酶存在時，兩個loxP位點可以同源重組。第52頁,共69頁，2024年2月25日，星期天PropertiesofCreandFlp?Sitespecific:位點特異性--34bp非對稱靶序列34bpasymmetricrecognitiontargetsequence?Conservative:保守--無核苷酸增加或減少recombinationoccurswithoutanyoverallgainorlossofnucleotides?Simple:簡單--不需要其他因子或能量recombinasefunctionsautonomously,nocofactorsorATPrequired第53頁,共69頁，2024年2月25日，星期天特定位點重組酶識別位點第54頁,共69頁，2024年2月25日，星期天?Substratetopology:底物的拓撲結構supercoiledcircular,relaxedcircularorlinearDNA?Heritableproduct:可遺傳的產物resultantgeneticalterationisstableandheritable?Broadutility:廣泛的應用functioninawiderangeofcelltypes,includingundifferentiatedaswellaspost-mitoticcellsfunctionoverlargedistances(Mb)PropertiesofCreandFlp第55頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Cre-loxP重組系統示意圖Cre酶作用于基因組上loxP位點Cre酶使兩個loxP位點聯合兩個loxP位點發生同源重組切除X基因及一個loxP位點而僅留下一個loxP位點。第56頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第57頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Cre-mediatedRecombination第58頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第59頁,共69頁，2024年2月25日，星期天染色體特定位點重組技術構建要導入靶細胞的靶載體首先，將載體導入胚胎干細胞（ES），篩選出發生同源重組的puro抗性細胞；篩選和鑒定；最后，用Cre表達質粒轉染細胞并瞬時表達，表達產生的重組酶Cre催化loxP位點間的染色體發生重組。第60頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第61頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第62頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第63頁,共69頁，2024年2月25日，星期天第64頁,共69頁，2024年2月25日，星期天Applications?GenetargetingKnock-out/Knock-in/Conditionalknock-out?Chromosomeengineering/ablationLargedeletionChromosomerearrangementG