青蒿素縮環(huán)二聚體和PI3Kα突變體抑制劑的設(shè)計(jì)、合成和抗腫瘤活性研究眾所周知,癌癥是當(dāng)前威脅人類健康的第一殺手,新型抗腫瘤藥物的研發(fā)也一直是社會(huì)關(guān)注的重點(diǎn)。由于腫瘤疾病的多樣性和復(fù)雜性,許多抗腫瘤藥物在臨床使用中經(jīng)常出現(xiàn)各類毒副作用。因此提高抗腫瘤藥物的靶向性和選擇性,開發(fā)既可高效的殺滅腫瘤組織又可降低對(duì)正常組織毒副作用的抗癌藥物具有重大而深遠(yuǎn)的意義。基于此,本論文擬采用兩種策略開展抗腫瘤藥物研究工作。其一,利用天然產(chǎn)物毒副作用小的優(yōu)點(diǎn),以其分子骨架為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)天然產(chǎn)物的新型衍生物,并提高其抗腫瘤活性。其二,針對(duì)腫瘤組織中某些特異存在的異常基因突變現(xiàn)象,通過高通量篩選技術(shù)獲得先導(dǎo)化合物,然后進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化得到全新骨架的小分子蛋白抑制劑。這類抑制劑精準(zhǔn)靶向突變基因表達(dá)的蛋白,具有較強(qiáng)抗腫瘤活性,同時(shí)毒副作用較低。本論文分為以下幾部分:Ⅰ.青蒿素五元縮環(huán)二聚體青蒿素及其衍生物是一類含三氧雜環(huán)倍半萜烯結(jié)構(gòu)的具有多種生物活性的化合物。目前,青蒿素及其衍生物已經(jīng)成為抗瘧疾臨床治療的一線用藥,而且安全無毒副作用。在抗腫瘤藥物研發(fā)領(lǐng)域,青蒿素也被廣泛關(guān)注。但是相對(duì)較差的抗腫瘤活性和代謝穩(wěn)定性是制約其在該領(lǐng)域廣泛使用的最大障礙。本論文第一部分工作以天然產(chǎn)物青蒿素為先導(dǎo)化合物,設(shè)計(jì)合成了一類新穎的青蒿素縮環(huán)二聚體結(jié)構(gòu),使用MTT法檢測(cè)了這類結(jié)構(gòu)在五株腫瘤細(xì)胞和一株正常肝細(xì)胞上的抗腫瘤活性。并基于此,詳細(xì)研究了這類化合物的構(gòu)效關(guān)系,而且對(duì)代表性化合物的抗腫瘤生物機(jī)理和代謝穩(wěn)定性進(jìn)行了研究和討論。與青蒿素相比,大部分新合成的二聚體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出更好的抗腫瘤活性,尤其是化合物A-8b對(duì)PC12細(xì)胞株表現(xiàn)出最佳的抗腫瘤活性(IC₅₀=1.56μM),較青蒿素和二氫青蒿素提高了50倍。進(jìn)一步生物學(xué)機(jī)制研究結(jié)果表明,化合物A-8b可以阻斷腫瘤細(xì)胞周期于G1期,同時(shí)通過上調(diào)Bad,Bax,caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá),抑制Bcl-xL的表達(dá)實(shí)現(xiàn)促凋亡作用。與控制組Dimer-01相比,化合物A-8b表現(xiàn)出延長(zhǎng)的代謝半衰期（從8min提高到18.3min）和較低的肝微粒體代謝清除率。說明化合物A-8b具有更好的代謝穩(wěn)定性。總之,本論文第一次成功將青蒿素縮環(huán)制備成了二聚體結(jié)構(gòu),開發(fā)了一類具有明顯提升抗腫瘤活性和代謝穩(wěn)定性同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞具有較好耐受作用的新型青蒿素衍生物,為青蒿素類衍生物成為抗腫瘤臨床藥物提供了有意義的前期研究基礎(chǔ)。Ⅱ.PI3Kα突變體抑制劑第二部分工作針對(duì)腫瘤細(xì)胞中異常高表達(dá)的PI3Kα突變體,開發(fā)相應(yīng)的小分子選擇性抑制劑,提高抗腫瘤化合物的選擇性和靶向性,同時(shí)降低毒副作用。PI3K通路在腫瘤細(xì)胞中異常活躍,近年來,作為一個(gè)有希望介入的抗腫瘤藥物靶標(biāo)備受關(guān)注。然而,當(dāng)前的PI3K抑制劑大都存在潛在的耐藥性和嚴(yán)重的毒副作用,在多種腫瘤細(xì)胞中,編碼催化亞基PI3Kα的PIK3CA序列出現(xiàn)頻繁的突變現(xiàn)象,而由此基因突變導(dǎo)致PI3Kα結(jié)構(gòu)的變化是激活該信號(hào)通路的重要原因之一。鑒于此,我們希望發(fā)展一種可以特異性作用于PI3Kα突變體的抑制劑,實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)治療效果的同時(shí)降低毒副作用。通過使用靶向PI3Kα（H1047R）突變體的同源時(shí)間分辨熒光分析技術(shù),篩選小分子化合物庫(kù),我們得到了兩個(gè)潛在母核結(jié)構(gòu)（Hit-01,Hit-02）,并分別開展了對(duì)這兩類母核結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾與作用機(jī)理研究工作。第一個(gè)母核結(jié)構(gòu)為含有苯乙酮骨架的化合物（Hit-01）。經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾,獲得了一系列對(duì)PI3Kα突變體激酶具有較好抑制活性,同時(shí)對(duì)突變體高表達(dá)腫瘤細(xì)胞株HCT116具有適中抑制活性的化合物。其中化合物B-7h表現(xiàn)出最為優(yōu)異的活性,其對(duì)突變體激酶抑制活性EC₅₀為0.555μM,較初始母核（Hit-01）提高了200倍;對(duì)HCT116腫瘤細(xì)胞株的抑制活性IC₅₀為10.91μM,較初始母核（Hit-01）提高了10倍。選擇HCT116細(xì)胞對(duì)其抗增殖活性機(jī)制進(jìn)一步研究后發(fā)現(xiàn)B-7h可以阻斷腫瘤細(xì)胞周期于G2/M期,但沒有促凋亡作用,其抗腫瘤作用是通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的自噬而實(shí)現(xiàn)。通過免疫印跡法,分析與細(xì)胞自噬和PI3K通路相關(guān)的蛋白的表達(dá),發(fā)現(xiàn)化合物B-7h可以激活細(xì)胞自噬調(diào)控蛋白并抑制PI3K的磷酸化。第二個(gè)母核結(jié)構(gòu)為具有喹喔啉結(jié)構(gòu)的化合物（Hit-02）。結(jié)構(gòu)改造獲得了另一系列的對(duì)突變體激酶和高表達(dá)該突變體的腫瘤細(xì)胞HCT116具有優(yōu)異抑制活性的化合物。其中,C-7b顯示了較強(qiáng)的對(duì)PI3Kα突變激酶的抑制活性(IC₅₀=0.137μM),較初始母核（Hit-02）提高了500倍。此外,對(duì)HCT116細(xì)胞株也顯示了較好的抑制作用。進(jìn)一步生物機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)C-7b可以阻斷HCT116細(xì)胞周期于G1期,并通過上調(diào)capase-8,caspase-3和caspase-9等促凋亡因子的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞凋亡,此外研究發(fā)現(xiàn)C-7b對(duì)PI3K的磷酸化具有明顯的抑制作用。最后,針對(duì)以上兩個(gè)代表化合物（B-7h和C-7b）,我們研究了其對(duì)PI3Kα（野生型/突變型）,PI3K其他亞型（PI3Kβ,γ和δ）以及mTORC1的選擇性抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)化合物對(duì)PI3Kα（野生型/突變型）具有相似的抑制作用,同時(shí)具有很好的PI3Kα異構(gòu)體選擇性,可以減少由于對(duì)PI3K其他亞型的抑制而產(chǎn)生的毒副作用。綜上所述,本論文兩部分工作都以設(shè)計(jì)全新的具有較好抗腫瘤活性的化合物,同時(shí)避免產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用為目標(biāo),分別采用天然產(chǎn)物和高通量篩選技術(shù)獲得先導(dǎo)化合物,然后經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)改造和構(gòu)效關(guān)系總結(jié),最終獲得了三個(gè)具有強(qiáng)效抗腫瘤活性同時(shí)具有較低毒副作用的候選