外泌體介導(dǎo)乳腺癌細胞對多柔比星耐藥性的作用及機制研究背景及目的乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤之一,同時也是引起女性相關(guān)腫瘤死亡的第二大原因。由于早期診斷和先進的治療策略的改善,乳腺癌的死亡率明顯下降。目前乳腺癌的治療策略通常將手術(shù)與多種輔助療法相結(jié)合,如化學(xué)療法,放射療法,激素療法,靶向療法。多數(shù)患者在一定時間內(nèi)對初始治療有反應(yīng),但仍有一部分乳腺癌會發(fā)展為更具侵襲性的腫瘤形式,這些形式通常對化療和放療有抵抗作用。因此,克服導(dǎo)致預(yù)后不良的乳腺癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)是我們目前的主要挑戰(zhàn)。近年來隨著各種新藥上市如內(nèi)分泌治療藥物、分子靶向藥物,乳腺癌在治療上取得了很大進步,但三陰性乳腺癌治療和晚期乳腺癌治療仍以化療為主。多柔比星在乳腺癌一線化療中有著重要的作用,但其的廣泛應(yīng)用使越來越多的患者對多柔比星產(chǎn)生了化療耐藥。隨著對化療耐藥作用及分子機制的進一步探索,作為基因貨物載體的腫瘤細胞來源的外泌體在細胞間耐藥信息的轉(zhuǎn)移逐漸引起研究人員的關(guān)注。外泌體是大多數(shù)細胞分泌的一種直徑介于40~100nm之間的小囊泡,其中含有各種活性分子,包括蛋白質(zhì)、脂類、DNA、RNA。外泌體作為細胞間信號傳遞的媒介,在腫瘤化療耐藥、侵襲轉(zhuǎn)移及免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤來源或與腫瘤相關(guān)的外泌體是參與調(diào)控腫瘤耐藥的重要介質(zhì),其可通過傳遞ncRNA、蛋白質(zhì)等生物學(xué)分子賦予腫瘤敏感細胞耐藥性。本文主要探討外泌體在乳腺癌細胞多柔比星耐藥傳遞中的作用及初步分子機制,旨在為乳腺癌對多柔比星的耐藥機制以及對逆轉(zhuǎn)耐藥的治療策略提供新的思路。方法1.選用乳腺癌親本細胞株(MCF-7)、多柔比星(doxorubicin)耐藥細胞株(MCF-7/Dox)及多柔比星耐藥細胞株上清液共培養(yǎng)的敏感細胞株(MCF-7/EXO)為細胞模型2.應(yīng)用CCK8法檢測多柔比星對MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox細胞增殖活性的影響。3.通過熒光顯微鏡觀察多柔比星對MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox細胞凋亡的影響。4.應(yīng)用超速離心法提取MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox細胞上清液中的外泌體,應(yīng)用透射電子顯微鏡、BCA法、DiI標記法檢測外泌體的含量,Westernblot法檢測外泌體特異分子CD63和Flotillin-1的表達水平。5.應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察MCF-7細胞對MCF-7/Dox細胞來源的外泌體的攝取情況。6.Westernblot檢測MCF-7、MCF-7/EXO、MCF-7/Dox細胞中多藥耐藥蛋白(ATP-bindingcassettesubfamilyBmember1,ABCB1)的表達水平。7.應(yīng)用SPSS21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t法,數(shù)據(jù)以x±s表示,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1.細胞增殖活性檢測顯示,MCF-7/EXO細胞對多柔比星的半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.83±0.09μmol·L-1,明顯高于MCF-7細胞的IC50值0.15±0.05μmol·L-1(P<0.01),其耐藥性提高了5.5倍。2.凋亡檢測顯示,多柔比星作用后,MCF-7細胞明顯發(fā)生凋亡(P<0.001),而與耐藥細胞上清共培養(yǎng)的MCF-7/EXO細胞凋亡不明顯(P>0.05)。3.外泌體定量及特異性標記物檢測顯示,MCF-7/EXO細胞的外泌體明顯多于MCF-7細胞(P<0.05)。4.PKH67示蹤標記顯示,MCF-7/ADR細胞來源的外泌體可以被MCF-7細胞攝取。5.Westernblot顯示,MCF-7/EXO細胞內(nèi)ABCB1的表達水平明顯高于MCF-7。結(jié)論1.多柔比星耐藥乳腺癌細胞可以分泌大量的外泌體。2.多柔比星耐藥乳腺癌細胞上清與乳腺癌敏感細胞共培養(yǎng)后,其上清中