關于高效液相色譜法簡介12

液相色譜分析是在經典的液體柱色譜基礎上，引入了氣相色譜的理論；在技術上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，實現了分析速度快、分離效率高和操作自動化，這種柱色譜技術被稱做高效液相色譜法。高效液相色譜分析概述第2頁,共43頁，2024年2月25日，星期天3慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液第3頁,共43頁，2024年2月25日，星期天4

葉綠素的柱色譜第4頁,共43頁，2024年2月25日，星期天5三組分混合物的分離第5頁,共43頁，2024年2月25日，星期天6在C18柱中，三組分混合物流出色譜柱的順序為：萘，聯二苯、蒽。

當試樣混合物進入色譜柱后，就在固定相和流動相之間不斷地進行分配平衡。不同的化合物，分子結構不同，存在理化性質的差異，所以在兩相中存在的濃度也各不相同。固定相中存在量多的化合物，沖洗出柱子的時間就長，反之則短。這與分配系數有關：

K=化合物在固定相中的濃度C固化合物在流動相中的濃度C流

K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用強，后流出柱子。第6頁,共43頁，2024年2月25日，星期天7第7頁,共43頁，2024年2月25日，星期天8

鍵合相-反相色譜第8頁,共43頁，2024年2月25日，星期天9§1.概述色譜法：(chromatography)：以試樣組分在固定相和流動相間的溶解、吸附、分配、離子交換或其他親和作用的差異為依據而建立起來的各種分離分析方法稱色譜法。幾個概念色譜柱：進行色譜分離用的細長管。固定相：管內保持固定、起分離作用的填充物。流動相：流經固定相的空隙或表面的沖洗劑。第9頁,共43頁，2024年2月25日，星期天10§1-4高效液相色譜法的特點一高壓

液相色譜以液體作為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。在現代液體色譜中供液壓力和進樣壓力都很高，一般可達到150～300kg／cm2，甚至可達700k／cm2以上。第10頁,共43頁，2024年2月25日，星期天11二高速

高效液相色譜所需的分析時間較之經典液體色譜快得多，一般可達l—10mL／min，

個別可高達100mL／min以上，這已近似于氣相色譜的流速。

三高效

氣相色譜的分離效能很高，高效液相色譜的柱效則更高，一般約可達

60000理論塔板／米；第11頁,共43頁，2024年2月25日，星期天12四高靈敏度

紫外檢測器的最小檢測量可達毫微克數量級(10-9g)；熒光檢測器的靈敏度可達10-11g。高效液相色譜的高靈敏度還表現在所需試樣很少；微升數量級的樣品就足以進行全分析。

第12頁,共43頁，2024年2月25日，星期天13§1-5高效液相色譜流程和設備

高效液相色譜儀一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統，進樣系統，分離系統和檢測系統。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動進樣及數據處理等。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經過進樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當注入欲分離的樣品時，流經進樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進行分離，然后依先后順序進入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。第13頁,共43頁，2024年2月25日，星期天14第14頁,共43頁，2024年2月25日，星期天15樣品吸收度測定—吸收池示圖第15頁,共43頁，2024年2月25日，星期天16紫外檢測器工作原理第16頁,共43頁，2024年2月25日，星期天17第17頁,共43頁，2024年2月25日，星期天18開始分析廢液樣品

淋洗液至分離柱進樣閥樣品裝樣廢液

淋洗液至分離柱定量環進樣（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥＣＴ）樣品環第18頁,共43頁，2024年2月25日，星期天19液相色譜動畫演示第19頁,共43頁，2024年2月25日，星期天20二、色譜圖（chromatogram）

試樣中各組分經色譜柱分離后，按先后次序經過檢測器時，檢測器就將流動相中各組分濃度變化轉變為相應的電信號，由記錄儀所記錄下的信號——時間曲線或信號——流動相體積曲線，稱為色譜流出曲線，或色譜圖。如圖12-2常用術語：1.基線:在操作條件下，僅有純流動相進入檢測器時的流出曲線。第20頁,共43頁，2024年2月25日，星期天212.色譜峰:當組分隨流動相進入檢測器時，其響應信號大小隨時間變化所形成的峰形曲線。正常的色譜峰呈正態分布。3.峰高與峰面積峰高：色譜峰頂點與峰底之間的垂直距離稱為峰高(peakheight)。用h表示。峰面積：峰與峰底之間的面積稱為峰面積(peakarea)，用A表示。第21頁,共43頁，2024年2月25日，星期天22§2－1保

留

值

一、保留時間（tR）從進樣開始到柱后出現樣品的濃度極大值所需的時間為保留時間，用tR表示。第22頁,共43頁，2024年2月25日，星期天23§2-2色譜柱的分離效率及柱效能的評價

一、塔板理論塔板理論認為，一根柱子可以分為n段，在每段內組分在兩相間很快達到平衡，把每一段稱為一塊理論塔板。設柱長為L，理論塔板高度為H，則

H=L/n式中n為理論塔板數。第23頁,共43頁，2024年2月25日，星期天24

色譜柱的分離效率（簡稱柱效），可定量地用理論塔板數N來表示。

理論塔板數一N還與柱長有關，當比較兩不同長度的色譜柱的柱效時，應當比較它們在相同柱長下的V值。理論塔板數N第24頁,共43頁，2024年2月25日，星期天25

可用半峰高處的峰寬(半峰寬）和保留時間的關系來表示理論塔板數N，這時關系式為：

N＝5．54(tR/Wt1/2)2﹙2﹚式中：Wt1/2-------------半峰寬例如，從圖2-3，測得tR=105mm、Wt1/2=4mm，求得N=3789，若此柱長為250mm,折成每米的理論塔板數約為15200.

第25頁,共43頁，2024年2月25日，星期天26§2-3分離度及影響因素一

分離度（分辨率)

研究色譜中有關分離問題時，首先就是要能定量地確定相鄰兩峰的分離程度。

從圖8-3可以看出，為了獲得較好的分離，就必須使最大峰值之間的距離增加，峰寬減小。第26頁,共43頁，2024年2月25日，星期天27第27頁,共43頁，2024年2月25日，星期天28一般用Rs來定量表達相鄰兩峰的分離程度，所以Rs是色譜中兩個組分分離好壞程度的標志。要求RS>1.5

tR1－tR2Rs=————————1/2(W1+W2)

式中tR1、tR2分別為兩組分的保留時間，W1

、W2為色譜峰的峰底寬度

.

第28頁,共43頁，2024年2月25日，星期天29§5高效液相色譜的定性和定量分析

§5-1定性分析

在液相色譜中保留值定性的方法主要是用直接與已知標準物對照的方法。當未知峰的保留值（tR′或VR′）與某一已知標準物完全相同時，則未知峰可能與此已知標準物是同一物質，特別是在改變色譜柱或改變洗脫液的組成時，未知峰的保留值與已知標準物的保留值仍能完全相同，則可以基本上認定未知峰與標準物是同一物質。第29頁,共43頁，2024年2月25日，星期天30§5-2定量分析

HPLC色譜定量的基本方法有內標法、外標法等。

外標法———標準曲線法是一種簡便、快速的絕對定量方法（歸一化法則是相對定量方法）。首先用欲測組分的標準樣品繪制標準工作曲線。第30頁,共43頁，2024年2月25日，星期天31具體作法是：用標準樣品配制成不同濃度的標準系列，在與欲測組分相同的色譜條件下，等體積準確量進樣，測量各峰的峰面積或峰高，用峰面積或峰高對樣品濃度繪制標準工作曲線，此標準工作曲線應是通過原點的直線。若標準工作曲線不通過原點，說明測定方法存在系統誤差。標準工作曲線的斜率即為絕對校正因子。第31頁,共43頁，2024年2月25日，星期天32

目前已普及于幾乎所有重要的分析學科領域和許多科研生產部門，高效液相色譜能較理想地分離和分析與生物醫學有關的大分子和離子型物質，易變質的天然產物，各種高分子化合物和不穩定化合物。

例如：蛋白質、核酸、氨基酸、多糖、顏料極性類脂肪化合物、藥物、染料、表面活性劑、農藥、甾族化合物、多環芳烴、合成聚合物、瞟吟、維生素、除銹劑、防老劑等等。

§6高效液相色譜的應用第32頁,共43頁，2024年2月25日，星期天33

高效液相色譜，特別適用于分離沸點高和熱穩定性差的物質，目前已廣泛用于化工、食品、醫藥、生化、衛生、環境保護和高能化合物等生產和科研工作中。第33頁,共43頁，2024年2月25日，星期天34

第34頁,共43頁，2024年2月25日，星期天35第35頁,共43頁，2024年2月25日，星期天36第36頁,共43頁，2024年2月25日，星期天37第37頁,共43頁，2024年2月2