產科晉升副主任醫師職稱（無創產前基因檢測診斷Pallister-Killian綜合征病例分析專題報告）Pallister-Killian綜合征(PKS)屬于染色體微缺失綜合征的一種,可導致患兒身體不同程度殘疾?生長發育遲緩或智力損傷等?PKS的臨床表現包括特征性顱面畸形?先天性心臟缺損?膈疝?癲癇和皮膚色素異常等[1]?PKS較為罕見,診斷困難,產前篩查是預防PKS患兒出生的有效手段[2]?本研究通過無創產前基因檢測(NIPT)診斷了1例PKS,現將結果報道如下?1臨床資料孕婦,27歲,孕2產1,孕18周,否認近親婚配,無遺傳病家族史?于外院行超聲檢查提示:胎兒先天性膈疝,股骨?肱骨低于M-2SD線,心臟移位至右側胸腔,肺動脈主動脈比值增大,心包積液,三尖瓣反流(少量)?因血清學產前篩查18-三體綜合征高風險于本院就診,18-三體綜合征風險值為1/266?產科醫生咨詢后,建議直接行羊水穿刺產前診斷,但孕婦因擔心羊膜腔穿刺風險,自愿選擇NIPT,在充分了解NIPT的優勢與局限性后,簽署知情同意書,并于孕22周時進行檢測?1.1NIPT靜脈采集10mL外周血,4℃下1600×g離心10min,取上清液2mL分裝后再次于4℃下16000×g離心10min,獲得的血漿繼續進行游離DNA提取,剩余標本于-80℃保存備用?標本DNA檢測合格后用PCR-free法進行文庫制備,采用Next-SeqCN500高通量測序儀(貝瑞基因公司)完成36bp的單端測序,檢測試劑盒為貝瑞基因公司生產的胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒(可逆末端終止測序法),測序深度為0.3×,并進行生物信息學分析?NIPT結果提示:13?18?21-三體無異常,但存在12號染色體短臂部分重復dup(12)(p13.33-p11.1),Z值為20.81,起始位置為chr12:200000-34499999,片段大小為34.3Mb,代表12號染色體短臂部分三體,見圖1,需行進一步的有創性診斷確診?1.2胎兒羊水細胞染色體核型分析

經產科醫生咨詢,簽署知情同意書后,于孕24周時行羊水穿刺?抽取羊水30mL,取10mL用于高通量測序,其余20mL分2管,以2000r/min離心10min后棄上清,取沉淀細胞,加適量羊水細胞培養基,接種于無菌培養瓶內,置于37℃?含5%二氧化碳的培養箱中靜置培養8~9d,常規收獲制片?以G顯帶染色制備染色體標本,對每例標本均按照《人類細胞遺傳學國際命名體制(2013)》標準,計數20個中期分裂相細胞,分析5個核型?胎兒羊水細胞染色體核型分析結果:47,XX,+i(12)(p10)[58]/46,XX[42],說明該標本為12號染色體短臂等臂染色體的嵌合體,見圖2?1.3胎兒羊水高通量染色體拷貝數變異檢測(CNV-seq)

提取羊水基因組DNA,進行文庫構建:通過片段化-連接?PCR前純化?PCR擴增?PCR后純化等過程,采用NextSeqCN500高通量測序儀(貝瑞基因公司),進行CNV-seq,測序結果經貝瑞基因公司Enli-ven?變異注釋系統標注?CNV-seq結果為:dup(12)(p13.33-p11.1)(mos),提示該標本12號染色體p13.33-p11.1處檢測到拷貝數為3.5,片段大小為34.70Mb的嵌合重復區域,起始位置為chr12:160001-34860000,見圖3?4?經查閱數據庫[包括Decipher數據庫?在線孟德爾遺傳數據庫(OMIM)?PubMed數據庫及UCSCGenomeBrowser數據庫],得出該標本的變異包含了PKS的全部區域,結合羊水細胞染色體核型分析與CNV-seq的結果,該標本確診為PKS?1.4孕婦及其配偶外周血染色體核型分析

為明確變異來源,對該孕婦及其配偶進行了外周血染色體核型分析,夫妻雙方G顯帶核型結果均未見異常,見圖5,說明胎兒染色體變異為新發2討

論

PKS的細胞遺傳學特點是特定組織中以嵌合體形式存在的12號染色體短臂等臂染色體,故也稱為等臂12p綜合征或12p四體綜合征?PKS的嵌合效應是由于額外染色體上攜帶的基因最終導致顱面部?心血管?腎臟和其他系統異常?PKS可累及體內所有器官及系統,其典型臨床表現如下:(1)特殊面容包括皮膚色素異常?粗狂面容?眼距寬?高腭弓?前額突出?短頸等;(2)神經系統異常包括腦結構異常?癲癇?肌張力減退;(3)心臟缺陷包括心房和室間隔缺損;(4)胸部受累包括肺發育不全?膈疝;(5)胃腸道表現包括腸旋轉不良及肛門移位;(6)骨骼肌肉系統發育異常包括PKS特有的生長模式,即在宮內提示明顯的生長過度現象,但在出生后立即表現為生長發育遲緩;(7)75%的PKS患兒還有一定程度的視力損傷[2-3]?PKS胎兒在妊娠中期超聲檢查中可顯示出明顯的異常,包括羊水過多?膈疝?中樞神經系統異常?胎兒水腫?顏面部異常?心室擴張?短肢畸形等?當超聲檢查提示羊水過多?膈疝?肢根骨短小,尤其伴有生長過度時,應首先考慮PKS[4]?本研究中該孕婦妊娠中期超聲檢查提示:胎兒先天性膈疝,股骨?肱骨低于M-2SD線,心臟移位至右側胸腔,肺動脈主動脈比值增大,心包積液,三尖瓣反流(少量)?符合PKS超聲檢查的主要特征?PKS具有特殊的細胞遺傳學特點,即異常的染色體有組織特異性,通常在皮膚成纖維細胞中可以檢測到異常?因此,由于嵌合體的組織特異性,PKS的診斷可能經常被遺漏,并且通常在快速分裂的細胞,如外周血淋巴細胞中不能檢測到[5-6]?已報道的病例中均未在外周血淋巴細胞中診斷出異常染色體i(12)(p10)[7]?據不同組織中期染色體核型分析統計,包含有異常染色體i(12)(p10)的組織包括:淋巴細胞(檢出率為0%~2%)?成纖維細胞(檢出率為50%~100%)?羊水細胞和骨髓細胞(檢出率均為100%)[8]?皮膚成纖維細胞中檢測嵌合體的成功率高于外周血,因為其異常細胞的損耗率低于T淋巴細胞[9]?本病例羊水細胞中i(12)(p10)檢出率為58%,說明CNV-seq技術可以精準地檢測出比例高于5%的嵌合體,也證明了在PKS的診斷方面,羊水細胞的檢出率較高?羊水CNV-seq結果顯示,12號染色體短臂重復,其拷貝數為3.5?一般來說,單純的染色體重復檢測到的拷貝數應為3,但該標本是12號染色體短臂等臂四倍體的嵌合體,所以導致其拷貝數為3.5?目前,診斷PKS的方法主要為細胞遺傳學及分子遺傳學兩類,本病例采用的細胞遺傳學技術為染色體核型分析,其是染色體檢查的“金標準”;但由于PKS特殊的細胞遺傳學特點,在不同組織中的檢出率有很大差別,所以染色體核型分析技術對PKS的檢出率并不高?本病例采用的分子遺傳學技術為CNV-seq,其不針對特定區域設計探針,而是進行全基因組測序,覆蓋了23對染色體,精確度高,可檢測到相對分子質量為100×103以上的染色體變異,并具有很好的重復性與擬合度,與芯片技術比較,具有成本低?通量高?覆蓋范圍廣及穩定性更高等優點?PKS屬于染色體微缺失綜合征的一種?染色體的微缺失或微重復都屬于染色體的拷貝數變異,可引起微缺失或微重復綜合征,導致患兒身體出現不同程度器官功能異常?生長發育遲緩或智力損傷等[10]?有研究顯示,有1.65%的孕婦在產前診斷中可檢出有臨床意義的染色體微缺失或微重復[11]?要想有效預防出生缺陷,就需要進行大規模的產前篩查,并對高風險人群進行產前診斷?NIPT作為高通量測序在臨床應用最成熟的領域,其檢測胎兒染色體非整倍體異常已經成為臨床產前篩查的重要部分?2015年國際產前診斷協會針對NIPT出臺了最新臨床應用指南,明確指出NIPT可對染色體微缺失或微重復進行檢測[12]?近年來,隨著測序技術的進一步發展,一些實驗室引入了染色體微缺失或微重復的無創產前篩查,作為除了整個染色體非整倍體檢測之外的另一種選擇,稱之為擴展性的無創產前篩查技術[13]?擴展病種的無創性產前檢測,篩查的范圍擴大到全染色體基因組7Mb的片段變異和常見的微缺失或微重復[14],但目前并沒有充足的臨床應用反饋數據?本研究中采用NIPT篩查出胎兒12號染色體短臂重復片段大小為34.3Mb,并通過CNV-seq證實與胎兒有創產前診斷結果相符,證明了NIPT對檢測染色體大片段的重復有較高的靈敏度