ICS67.120.30B50

DB13河 北 省 地 方 標 準DB13/T1778—2013魚類鏈球菌病診斷技術規范Thenormofdiagnosistechniquestreptococcicosisinfish20132013090520130930河北省質量技術監督局發布DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013前 言本標準按照GB/T1.1—2009給出的規則起草。本標準由河北省質量技術監督局提出。本標準起草單位：河北省水產養殖病害防治監測總站。薛政。IIDB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—20135培養基和試劑DB13/T1778—20135培養基和試劑魚類鏈球菌病診斷技術規范范圍本標準規定了魚類鏈球菌病的診斷方法。本標準適用于魚類鏈球菌病病原菌的鑒定及本病的流行病學調查、診斷、檢疫和監測。（）GB/T4789.28食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑GB/T6682分析實驗室用水規格和試驗方法術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.13.1病原菌鏈球菌（Streptococcus）（Streptococcus（Streptococcusagalactiae）（Streptococcusmillieri）（Streptococcusparauberis）（Streptococcusdysgalactiae）乳鏈球菌是引起魚類鏈球菌病的主要病原菌。4設備和材料a)b)顯微鏡：10×～100×。滅菌乳缽。0.1g。PCR電泳儀。1培養基和試劑包括：GB/T6682Todd-HewittTHB)。GB/T4789.2875％酒精。GB/T4789.283％H2O2（）。TaqDNAh)酚/氯仿/異戊醇（25∶24∶1）。瓊脂糖。溴化乙錠（EB）。dNTP：dATP、dCTP、dGTPdTTP10mmol/L。PCR639bp10μmol/LDNA（Marker）。DNA（Marker）。-20℃。6診斷步驟外部檢查l解剖檢查涂片檢查用75%（GB/T4789.282脂平板。25g225mLTHB24±2h28℃24h2h，48hβ0.2μm～1.0μm按GB/T4789.28（見附錄A.2）于10℃培養（PCR）本方法與6.4的方法可任選其一。取樣1.0g5.0mLTEA.3DNA90μL1.5mL10μL(10mg/mL),37℃水浴1hK5μL(20mg/mL),371h，加入RNA10μL(10mg/mL),3730min,150μL25∶24∶1)312000r/minmin，100μLTEPCRDNA，4也可以使用能夠達到同種效果的商業化細菌DNA提取試劑盒。PCRPCR50μL，10×PCRbuffer5μL，MgCl2（25mmol/L）4μL，dNTPs（μL，E1、E2（10μmol／L）1μL，TaqDNA（5Ｕ/μL）0.5μL，模板DNA2μL，35.5μL。PCR：945min；94℃1min，58℃退火45s，72℃1min，共35循環；72℃延伸10min，最后4℃保溫。每次反應應設立陽性對照、陰性對照和空白對照。將海豚鏈球菌或無乳鏈球菌標準菌株分別接種于THB增菌液中，28℃培養18h～24h，搖勻后取1mL，用無菌生理鹽水稀釋至106～108CUF/mL（約麥氏比濁度0.4），按6.5.2的方法提取細菌DNA做為PCR反應的陽性模板。以DNA提取液代替陰性對照模板。以水替代空白對照模板。3DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013DB13/T1778—2013PCR擴增反應試劑也可以使用能夠達到同種效果的商業化PCR擴增試劑盒。（A.4）1.50.5μg/mLEB6μL2μL6）DNA（Marker）。5V/cm45min用紫外分析儀或紫外觀察燈觀察瓊脂糖凝膠；Marker639bp639bp如在639bp位置無條帶，或條帶不在此位置，則判定為鏈球菌陰性。7綜合判定具有6.1、6.2、6.3全部或部分癥狀，并且病原菌經6.4或6.5鑒定為鏈球菌，判定為魚類鏈球菌病。44附錄A（規范性附錄）試劑配制標準中所用試劑，除特別注明外，均采用分析純試劑。Todd-Hewitt肉湯（THB)牛肉膏5.0g胰蛋白胨20.0g葡葡糖2.0g碳酸鈉2.5g氯化鈉2.0g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)0.4g蒸餾水1000ml將以上各成份混合煮沸，完全溶化，冷卻至室溫后，調pH，于115℃滅菌10min，最終pH為7.8。營養肉湯蛋白陳蛋白陳10g3g5g1000mLH至7.4225，121℃高壓滅菌15i。A.31×TE1MTris-HCl（PH=8.0）0.5MEDTA（PH=8.0）5ml1ml500l40L00l后，高溫高壓滅菌；室溫保存。A.45×TBE電泳緩沖液Tris硼酸（HBO3EDTA水54g27.5g2.922g1000mL5mol/L（HCl）pH8.3，5EB(ethidiumbromide用水配制成10mg/mL的濃縮液，用時每10mL電泳液或瓊脂糖中加1μL。上樣緩沖液每100mL水溶液中含溴酚藍0.25g，蔗糖40g。66附錄B（資料性附錄）鏈球菌（EF-Tu）tuf基因序列（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgtattcatgaacaaagttgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattggtt121gaaatggaaattcgtgaccttctttcagaatacgacttcccaggtgatga181atccaaggttcagctcttaaagcacttgaaggcgacgaaaaatacgaaga241gaattgatgagcactgttgatgagtacattccagaaccagaacgtgatac301ttacttcttccagttgaagatgtattctcaatcactggacgtggtacagt361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaagttgaaatcgttgg421gatatccaaaaagcagttgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaact481cttgcaggggacaacgttggtgttcttcttcgtggtgttcaacgtgatga541ggtcaagttcttgctaaaccaggttcaatcaacccacacactaaatttaa601tacatcctttctaaagaagaaggtggacgtcatactccattcttcaacaactaccgtcca661caattctacttccgtacaactgacgtaacaggttcaatcgaacttccagcaggaacagaa721atggttatgcctggtgataacgttactatcgaagttgaatt//（EF-Tu）tuf1ggaccaatgccacaaactcgtgagcacatccttctttcacgtcaagttggtgttaaacac61cttatcgttttcatgaacaaaattgaccttgttgatgatgaagaattgcttgaattagtt121gaaatggaaatccgtgatcttctttcagaatacgatttcccaggtgatgaccttccagtt181atccaaggttcagctcttaaagctcttgaaggcgatgaaaaatacgaagacatcgttatg241gaattgatggctactgttgattcatacattccagaaccagaacgtgatactgacaaacca301ttgcttcttccagttgaggatgtattctcaatcactggacgtggtactgttgcttcagga361cgtatcgaccgtggtactgttcgtgtcaacgacgaaatcgaaatcgttggtattaaagaa7421gaaactcaaaaagctatcgttactggtgttgaaatgttccgtaaacaacttgacgaaggt481cttgcaggagacaacgtaggtatccttcttcgtggtgttcaacgtgacgaaatcgaacgt541ggacaagttattgctaaaccaggttcaatcaacccacatactaaatttaaagg