尼古丁通過激活大麻素受體減輕Aβ1-42所致神經損傷的實驗研究阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是種常見的中樞神經系統退行性疾病,主要表現為進行性的學習和認知功能減退。研究表明,AD發生認知功能減退的重要原因之一是腦內β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)對神經細胞的毒性作用,過量的Aβ可損傷神經元和激活小膠質細胞。因此,降低Aβ的神經毒性是防治AD的主要方法之一。一些流行病學研究顯示,吸煙人群AD發病率明顯低于非吸煙人群,提示煙草中的主要成分尼古丁可能具有抗Aβ所致的神經損傷作用,但其作用機制尚未完全闡明。大量文獻證明,激活腦內大麻素(cannabinoid,CB)系統具有神經保護作用。大麻素CB1受體激活后可保護神經元,大麻素CB2受體激活可抑制小膠質細胞過度活化。此外,饒有興味的是,大麻素受體拮抗劑可用于治療尼古丁成癮,天然大麻素四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC)也可減輕尼古丁戒斷癥狀。上述證據提示,尼古丁的部分生物學效應可能通過大麻素受體介導。本實驗我們將神經元細胞系HT22細胞暴露于Aβ1-42,建立Aβ神經元損傷模型,觀察尼古丁對HT22細胞的保護作用;采用Aβ1-42刺激小膠質細胞系N9細胞,建立Aβ小膠質細胞激活模型,觀察尼古丁抑制N9細胞過度活化的作用;并對大麻素受體和PKC(proteinkinaseC,PKC)在其中的作用進行探索。我們在實驗中發現,CB1受體介導了尼古丁保護HT22細胞抗Aβ1-42損傷;CB2受體介導了尼古丁抑制Aβ1-42引起的N9細胞激活;尼古丁通過大麻素受體產生的神經保護作用需要PKC的參與。由于煙草戒斷研究中發現小劑量尼古丁制劑(如電子香煙、尼古丁貼片)具有低毒性、低成癮性等優點,本研究的結果將為探明尼古丁的神經保護作用機制和拓寬尼古丁的可能臨床適應癥提供實驗證據,也為AD的治療方法提供了新思路。第一部分大麻素CB1受體介導尼古丁保護神經元的研究實驗一尼古丁對神經元的保護作用觀察目的:Aβ神經元損傷模型的建立和尼古丁(nicotine,Nico)最佳保護濃度的確定。方法:將HT22細胞分為對照組和1、5、10μM的Aβ1-42損傷組,孵育24h后,用噻唑藍(thiazolylbluetetrazoliumbromide,MTT)方法以檢測細胞活力。隨后,將HT22細胞分為6組,分別為對照組、5μM的Aβ1-42損傷組和不同濃度(1、10、100和500μM)的尼古丁保護組,孵育24h后,MTT法檢測細胞活力。結果:5μM的Aβ1-42損傷24h,可降低HT22細胞活力至對照組的60%左右,選擇5μM作為Aβ1-42的損傷濃度進行隨后實驗。100μM的尼古丁,可顯著恢復細胞活力,選擇100μM的尼古丁進行隨后機制研究。結論:我們選擇5μMAβ1-42建立神經元損傷模型,使用100μM尼古丁研究其保護機制。實驗二CB1受體介導尼古丁對神經元的保護作用目的:觀察大麻素CB1受體在尼古丁保護HT22細胞中的作用。方法:將HT22細胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ損傷組、Nico保護組、CB1拮抗劑AM251干預組和AM251對照組。孵育24h,MTT法檢測細胞活力、比色法檢測培養基內乳酸脫氫酶(lacticdehydrogenase,LDH)含量、流式細胞儀檢測細胞凋亡率、Westernblot觀測CB1蛋白和凋亡相關蛋白Bcl2、Bax表達。結果:與Aβ損傷組比較,Nico保護組細胞活力增加(P<0.05),LDH釋放減少(P<0.05),細胞凋亡率降低(P<0.05),CB1和Bcl2表達上調(P<0.05),Bax表達下調(P<0.05)。CB1拮抗劑AM251顯著逆轉了尼古丁的上述作用(P<0.05)。結論:CB1受體介導了尼古丁對HT22細胞的保護作用。實驗三PKC在尼古丁保護神經元中的作用目的:觀察PKC在尼古丁保護HT22細胞中的作用。方法:將HT22細胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ損傷組、Nico保護組、CB1拮抗劑AM251干預組和AM251對照組。采用Westernblot測定細胞膜上和細胞質內PKC蛋白表達,計算二者比值,檢測PKC激活程度。隨后,將HT22細胞分為5組,分別為空白對照組、Aβ損傷組、Nico保護組、PKC抑制劑白屈菜紅堿(chelerythrine,Che)干預組和Che對照組。處理24h,采用相差顯微鏡觀察細胞形態,MTT法測定細胞活力,并檢測LDH釋放量。結果:與Aβ損傷組相比,Nico保護組PKC激活水平顯著升高(P<0.05);CB1拮抗劑AM251逆轉了尼古丁的上述作用(P<0.05)。與Aβ損傷組相比,Nico保護組細胞形態改善,細胞活力增加,LDH釋放減少(P<0.05);PKC抑制劑Che逆轉了尼古丁的上述作用(P<0.05)。結論:PKC作為CB1受體信號下游介導了尼古丁對HT22細胞的保護作用。第二部分大麻素CB2受體介導尼古丁抑制小膠質細胞活化的研究實驗一尼古丁抑制小膠質細胞激活作用觀察目的:建立Aβ小膠質細胞激活模型和確定尼古丁最佳作用濃度。方法:將N9小膠質細胞分為對照組(Control)和1、2.5、5、10μM的Aβ1-42刺激組。處理24h,采用Westernblot檢測細胞誘導型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)蛋白表達水平。隨后,將N9小膠質細胞分為6組,分別為對照組、5μM的Aβ1-42刺激組和不同濃度(1、10、100、500μM)的尼古丁處理組,24h后,ELISA法檢測培養基內TNF-α和IL-6含量。結果:5μM的Aβ1-42顯著上調N9細胞iNOS蛋白表達(P<0.05)。100μM的Nico顯著降低N9細胞TNF-α和IL-6釋放量(P<0.05)。結論:我們選擇5μMAβ1-42建立小膠質細胞激活模型,使用100μM尼古丁研究其抑制N9細胞活化的機制。實驗二尼古丁減輕小膠質細胞激活的機制研究目的:探討尼古丁減輕N9小膠質細胞活化的機制。方法:將N9細胞分為5組,分別為空白對照組(Control)、Aβ損傷組、Nico處理組、CB2拮抗劑AM630干預組和AM630對照組,孵育24h,采用Westernblot、免疫細胞化學法檢測CB2、iNOS、精氨酸酶-1(arginase1,Arg-1)蛋白表達;采用ELISA法測量培養基內TNF-α、IL-6、IL-10和腦源性神經營養因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)的濃度。隨后,將N9小膠質細胞分為Control組、Aβ損傷組、Nico處理組、PKC抑制劑Che干預組和Che對照組,孵育24h,檢測培養基內TNF-α、IL-6、IL-10和BDNF濃度。結果:與Aβ損傷組比較,Nico處理組細胞iNOS表達下調(P<0.05),Arg-1表達上調(P