1GB/TXXXX—202X農作物種子檢驗規程播種質量生活力四唑測定本文件規定了采用四唑測定種子生活力的程序。本文件適用于農作物種子。2規范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.1農作物種子檢驗規程總則GB/T3543.2農作物種子檢驗規程扦樣GB/T3543.3農作物種子檢驗規程播種質量凈度分析GB/T3543.4農作物種子檢驗規程播種質量發芽試驗3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1種子生活力seedviability種子潛在的發芽能力或種胚具有的生命力。4總則四唑測定作為種子生活力的一種快速測定方法。判定種子有無生活力，主要取決于胚、胚乳、外胚乳、配子體等組織的壞死部位和面積，而不一定在于染色顏色的深淺，顏色的深淺可以判定組織是否健壯、衰弱或死亡。種子生活力四唑測定在實踐中具有廣泛的應用，主要適用于下列情形：2GB/TXXXX—202X——收獲后需要盡快播種的種子；——已萌發的種子、收獲期間損傷的種子；——具有深度休眠的種子、發芽緩慢的種子；——要求快速了解發芽潛力的種子、發芽試驗末期懷疑休眠的部分種子。四唑測定所顯示的生活力是處于休眠狀態種子所具有的獨特特征。種子處在休眠狀態下，生活力與發芽率有明顯的差異。然而，對于下列情形，種子生活力與發芽率兩者之間不存在顯著差異：a）沒有休眠、非硬實的種子，或已經過破除休眠和硬實處理的種子；b）未曾感染或已經消毒的種子；c）種子生產過程未噴施、加工過程未包衣、貯藏過程未熏蒸使用有害化學物質處理的種子；d）未曾萌芽的種子；e）在規定或延長的發芽試驗期間未劣變的種子；f）在適宜條件下能正常發芽的種子。5原理四唑測定是利用無色溶液2，3，5-三苯基氯化（或溴化）四唑作指示劑，在種子組織內參與活細胞的還原反應，從脫氫酶接受氫離子，使無色的四唑經過氫化作用，在活細胞中產生紅色、穩定、不易擴散且不溶于水的三苯基甲臜。依據四唑染成的部位和顏色，區分為完全染色的有生活力種子、完全不染色的無生活力種子，以及存在壞死組織或者部分染色種子。6器具和試劑6.1器具a）能保持（35±2）℃的恒溫且控溫范圍（15～40）℃的電熱恒溫箱或發芽箱；b）能保持（5～10）℃溫度的冰箱；c）體視顯微鏡或手持放大鏡；d）感量為0.001的天平；e）刀片、解剖針、小針等切刺工具；f）棕色定量加液器、不同規格的染色盤；g）濾紙、吸水紙和毛巾等預濕物品。3GB/TXXXX—202X6.2試劑6.2.1四唑溶液四唑溶液通常使用濃度為0.1%～1.0%（m/v其pH值應為6.5～7.5之間。四唑溶液可用蒸餾水或去離子水直接配制，確保pH值為6.5～7.5之間的宜采用磷酸緩沖液來配制。配制成的四唑溶液應在黑暗或棕色瓶中低溫貯存，在5℃~10℃的黑暗條件下通?？杀４嬉荒辍?.2.2磷酸緩沖液溶液I：稱取9.078g磷酸二氫鉀(KH2PO4)溶解于1000mL蒸餾水/去離子水中。溶液Ⅱ：稱取9.472g磷酸氫二鈉(Na2HPO4)或11.876g二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·2H2O)溶解于1000mL的蒸餾水/去離子水中。取溶液Ⅰ2份和溶液Ⅱ3份混合后即得磷酸緩沖液，檢查其pH值在6.5～7.5之間。7測定程序7.1試驗樣品獲取從充分混合的凈種子（見GB/TXXXXX.X凈度分析）中，隨機數取4個重復，每個重復100粒。對于只測定發芽試驗末期懷疑休眠的部分種子，則可使用發芽試驗末期的所有新鮮不發芽種子、硬實種子。7.2染色前種子制備7.2.1預濕處理染色之前，種子宜進行預濕處理。對于種皮妨礙吸濕的或使染色更為均勻的，預濕處理前應進行相應的處理，例如：可先除去種子的外部附屬物(比如：水稻種子除去內外稃殼)，對于種皮妨礙吸脹的應在種子非要害部位刺穿種皮（比如：棉花、豆科硬實種子刺破種皮）。預濕可選擇下列之一的方式：a）采取緩慢潤濕，按照GB/TXXXXX.X發芽試驗的程序，將種子置于紙上（TP）或者紙間(BP)進行緩慢潤濕，適用于直接浸在水中容易破裂和損傷的種子、陳種子和干燥種子；b）采取水中浸漬，宜將種子完全浸在水中進行浸漬預濕，浸漬溫度宜采用20℃~30℃或30℃,使其達到充分吸脹，若浸漬時間超過24h應換水。適用于對于緩慢潤濕不能達到充分吸脹，且直接浸入水中不會造成組織破裂損傷的種子。不同種類種子的預濕方式和時間的技術規定，見表A.1的規定。采用較高（40±2）℃或較低的溫4GB/TXXXX—202X度處理時，預濕時間可作相應的調整。預濕期間，有些種子可能會產生粘稠物質，應予清除。清除可采取表面干燥、夾在布里或紙張間揩擦，或在1%～2%硫酸鋁鉀[AlK（SO4）2·12H2O]溶液中浸泡5min等方法。7.2.2染色前準備7.2.2.1總則許多種子染色前，需要進行準備處理，使種子組織暴露出來，利于四唑溶液的滲透，便于觀察鑒定。對于種皮妨礙染色的種子，為使組織暴露，可采用刺穿、縱切、橫切、橫剖、分離胚、剝去種皮等處理方式。不同種子的染色前準備處理技術規定，見表A.1規定。準備處理的種子應始終保持組織濕潤，直至各重復均處理完畢為止。7.2.2.2刺穿種子可利用解剖針或解剖刀，對于經預濕的種子或硬實種子，在種子的非要害組織部位進行刺穿。7.2.2.3縱切種子縱切可選用下列的方式：a）對于禾谷類種子，可從種子基部沿胚軸的中線縱切，切口長度約至胚乳長度的四分之三處；b）對于具有直立胚的無胚乳雙子葉植物種子，縱向切去略離中軸一半而不傷及胚軸的子葉；c）對于胚被有生命的組織包圍的種子，靠近胚縱切種子。7.2.2.4橫切或橫剖種子橫切可選用下列的方式：a）沿種子非要害組織橫向切開，對于禾本科種子，在緊靠胚上部的位置橫切，將含胚部分浸入四唑溶液；b）對于具有直胚無胚乳的雙子葉種子，橫向切除子葉末端部分1/3到2/5部分。對于小粒種子，可采用切開而未切斷的橫剖，作為橫切的替代方式。7.2.2.5分離胚對于大麥屬（Hordeum）、黑麥屬（Secale）和小麥屬（Triticum）種子，可采用解剖針來分離胚。在盾片上部稍偏中心處刺穿胚乳，輕微扭動使胚乳縱裂，從胚乳中挑出帶有盾片的胚，隨即移入四唑溶7.2.2.6去除種皮對于不適合刺、切的種子，采取剝去全部種皮（和其他某些被覆蓋組織）。5GB/TXXXX—202X對于具有堅硬的種子外部被覆物，如堅果和核果，可在種子干燥或預濕后將種子劈開或敲裂，但注意避免傷及胚部。種皮在預濕后用解剖針或解剖刀小心撕開剝掉。7.3染色應將準備處理好的種子或種胚完全浸入四唑溶液中，置于黑暗或弱光的控溫設備內進行染色。對于一些難以處理的小種子，可先放在紙條上進行預濕和暴露處理，然后將紙條折疊或卷起后浸入四唑溶液不同類型的種子，宜采用表A.1規定的四唑溶液濃度、染色溫度和時間。染色時間因種子種類、種子處理方法、種子生活力強弱、四唑溶液濃度和染色溫度等因素的不同而有所差異。一般來說，四唑溶液濃度和溫度越高，染色時間越短。染色溫度可在表A.1規定的溫度上下浮動，但應在（20～40）℃之染色時間則應減少或增加一半。種子在規定時間內仍然染色不完全的，可延長染色時間。但注意，應避免染色過度，這樣可能掩蓋種子因遭受特定傷害（如凍傷）、本身衰弱等而呈現的不同染色圖樣，從而影響鑒定結果。染色過程中，可能出現帶有黑色沉淀物泡沫的，可在四唑溶液中加入微量的殺菌劑或者抗生素消除干擾。種子染色結束后，倒去四唑溶液，用清水沖洗和檢查后再進行鑒定。7.4鑒定7.4.1鑒定前處理染色結束后應立即進行鑒定。鑒定前，可將已染色的種子樣品加以適當處理，使種胚的主要構造和其他活的營養組織暴露出來，以便于鑒定和計數。不同種類種子的處理方法見表A.1。對于種皮不透水（如豆科）和預濕后仍保持堅硬狀態的硬實種子，應按照表A.1要求進行處理。7.4.2鑒定四唑測定的主要目的是區分有生活力種子和無活力種子。依據種類的不同，判定種子有無生活力，主要取決于那些能發育成為正常幼苗的功能組織和組織完整度的染色狀況。鑒定時，應考慮種子的整體構造。大多數種子具有主要構造和營養組織，主要構造為分生組織和對發育成為正常幼苗所必需的結構。對于發育良好和分化良好的種子或種胚，即使主要構造的表面有小范圍的組織壞死，但仍具有修復能力的，可視為有生活力種子。鑒定需要細致的識別，其小范圍的組織壞死允許的面積范圍見表A.1。對于種子或種胚完全染色的，或者種子或種胚部分染色而其允許的無生活力組織未超過表A.1規定6GB/TXXXX—202X的，視為具有生活力種子。對于不符合認定為具有生活力種子要求的，而且種子沒有呈現非特征性著色和/或主要構造軟弱的，視為無生活力種子。此外，對于胚或主要構造明顯不正常的種子，無論染色與否，均應歸于無生活力種子。鑒定時，依據所顯示的染色模式和組織穩定性，檢查并評估每粒種子是否具有生活力。適當的光線和放大倍數對于適當的檢查識別是必不可少的。8結果計算與表示分別統計每一重復有生活力種子的數目，計算生活力平均百分率，修約至最近似的整數。重復間的最大容許誤差不應超過表B.1的規定。種子生活力測定的最大容許誤差，與發芽試驗相同。比較同一個實驗室的兩份獨立樣品的結果是否兼容，采用表B.2的容許差距；比較不同實驗室的兩份獨立樣品的結果是否兼容，采用表B.3的容許差距。在這兩種情形下，先計算兩次測定的平均值，若兩次測定結果的差距未超過兩次測定平均值所對應的最大容許誤差，則兩次測定結果視為可靠。9結果報告采用四唑測定種子生活力，應填報下列結果和說明：a）對于常規的種子生活力測定，表述為：“四唑測定：有生活力種子百分率為%”，試驗偏離表1技術規定的應加以注明；b）對于發芽試驗末期未發芽種子的生活力測定，表述為：“四唑測定：粒種子中具有生活力種c）對于豆科種子，若未測定硬實種子生活力，表述為：“四唑測定：有生活力種子百分率為%，硬實種子百分率為%”；若已測定硬實種子生活力，表述為：“四唑測定：有生活力種子百分率為%，其中包括硬實種子百分率為%”；d）對于包衣種子，應注明包衣種子類型和測定結果，表述為：“種子四唑測定：有生活力種子百分率為%”。依據送驗者的要求，可以酌情確定填報空殼、帶有幼蟲、破損或腐爛種子的百分率的結果。7GB/TXXXX—202X四唑測定種子生活力的技術要求A.1測定方法的技術要求四唑測定種子生活力的技術要求見表A.1。表A.1四唑測定種子生活力的技術要求種（變種）名稱鑒定前鑒定標準（允許沒有生活力的最濃時SecalecerealeL種3h~a.縱切胚和四分之三胚b.分離帶質0.5~1a.觀察b.觀察胚和盾片a.盾片上下任一端三分之一不染b.胚根大部分不染色，但不定根盾片中央有不染色組織，表明受到熱普通燕麥AuenasativaL.中殼，縱切胚和四分之三b.在胚部附a.觀察b.沿胚中縱切胚和大觀察切面胚根；盾片上下任一端三分之一Panicum中a在胚部附b.沿胚乳尖端縱切二之一切開或使胚露出胚根頂端三分之中縱切胚和大觀察切面a.胚根頂端三分b.盾片上下任一端三分之一不染色8GB/TXXXX—202X表A.1四唑測定種子生活力的技術要求（續）稱備理明濃h中面胚根頂端三分之a.胚根頂端三分b.子葉表面有小FagopyrumFagopyrum中面a.胚根頂端三分b.子葉表面有小PhaseolusPisumsativumL.WilczekArachishypogaeaDolichoslablabViciafabaL.a.胚根頂端不染b.子葉頂端不染色，花生為四分分之一9GB/TXXXX—202X表A.1四唑測定種子生活力的技術要求（續）稱備明濃hmoschataDuchesneexPoiinetLufaspp.Masum.etNakaiBenincasehispidaMomordicacharantiaL.LagenariasicerariaStand.中在20℃~液2~膜a.胚根頂端不染b.子葉頂端不染色二分之一菜菜菜菜BrassicaBrassicaL.ssp.chinensisBrassicaL.ssp.pekinensis(Lour.)OlssonBrassicanapusL.BrassicaoleraceaBrassicaoleraceaRaphanussativusBrassicajuncea中出a.胚根頂端三分b.子葉頂端有部GB/TXXXX—202X表A.1四唑測定種子生活力的技術要求（續）稱備明濃hAlliumspp.0.5~b.切去出b.不與胚相連的胚乳有少量不染色frutescensL.frutescensSolanumLycopersicon中在20~中3~0.5~胚和胚乳全部染色卜sativumL.ApiumgraveolensDaucuscarotaL.FoeniculumvulgareMill.在20~三分之一0.1~b.縱切胚和胚乳全部染色屬英Medicagossp.Melilotusssp.Astragalussinicus0.5~b.子葉頂端三分之一，如在表面可二分之一不染GB/TXXXX—202X表A.1四唑測定種子生活力的技術要求（續）稱備明濃hLactucasativaL.2～4h（非胚根b.子葉頂端二分之一表面不染色，或三分之一葵Helianthus殼b.子葉頂端表面二分之一不染BetavulgarisL.0.1~24~b.子葉頂端三分Spinaciaoleracea0.5~出A.2染色前準備處理圖示圖A.1為染色前種子處理的不同方式示意圖，示例1為禾谷類種子通過胚和約在胚乳四分之三處GB/TXXXX—202X縱切，示例2為燕麥種子在緊靠胚上部的位置橫切，示例3通過胚乳末端部分縱切，示例4為胚乳靠近胚的中間位置刺穿，示例5為萵苣、菊科其他屬通過子葉末端一半縱切，示例6為縱切