腫瘤動物模型耿飛鄭雅元2015342056導師孔維腫瘤動物模型一.自發性腫瘤動物模型二.誘發性腫瘤動物模型三.移植性腫瘤動物模型及其研究方法四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型一、自發性腫瘤動物模型定義：實驗動物不經人為實驗處理而自然發生的腫瘤，成為自發性腫瘤實驗動物選擇：高發病率的實驗動物一般選用小鼠（mouse）常用腫瘤模型小鼠腫瘤自然發生率自發性腫瘤動物模型的優點自然發生，腫瘤發生學與細胞學特點與人類腫瘤相似。2.便于慢性治療及綜合治療。3.發生條件自然，可通過細致觀察研究發現新的環境致癌因素及其他致癌因素；可以著重觀察遺傳因素在腫瘤發生中的作用。自發性腫瘤動物模型的缺點腫瘤發生情況參差不齊。難以短時間內獲得大量腫瘤材料，耗時長，耗資大。發生腫瘤的動物腫瘤生長速度差異大，難以評價。二、誘發性腫瘤動物模型定義：使用致癌因素(Carcinogens)在實驗條件下誘發動物發生腫瘤的動物模型。原理：利用外源性致癌因素引起細胞遺傳特性異常而呈現出異常生長和高增殖活性，形成腫瘤。用于誘發實驗性腫瘤的動物種類很多，以嚙齒動物的使用最多、應用最廣，包括各種大鼠、小鼠、豚鼠等誘發性腫瘤模型動物選擇誘發性腫瘤動物模型建立方法原位誘發致癌物直接與動物靶組織或靶器官接觸而誘發該組織或器官發生腫瘤。異位誘發將與致癌物接觸后的動物組織或器官埋置于該動物或另一正常動物皮下而產生的該組織或器官的腫瘤。誘發性腫瘤動物模型建立方法致癌物致癌物1.涂抹法（皮膚癌）2.經口給藥法（消化道或消化腺)3.注射法4.氣管灌注法（肺癌）5.穿線法6.埋藏法誘發性腫瘤模型——致癌物給予途徑誘發性腫瘤模型——舉例[特點]：①DEN總量達868mg，觀察時間為100天，發癌率可達40％，DEN總量達1176mg，觀察時間為半年時，發癌率可達94％，其中支氣管鱗狀細胞癌占41％。②烏拉坦注后3個月肺腺癌發生率為100％，且多數為多發性，誘發肺腫瘤的部位和組織分型與人類肺腫瘤相近似。[特點及應用]：DEN誘發大鼠致癌率為70％．DBA誘癌率為60％，黃曲霉素誘發大鼠肝癌發生率為80％，此種方法從病因學角度分析，與人體腫瘤較為近似，故此類模型常用于腫瘤特點的深入研究。三.移植性腫瘤動物模型及其研究方法定義：模型是指將動物或人體腫瘤移植到同種或異種動物體內連續傳代而形成移植性腫瘤動物的腫瘤實驗動物選擇：移植性腫瘤常用動物為小鼠、大鼠和地鼠腫瘤細胞的選擇：篩選抗癌藥物時，最好選用3類瘤株，及肉瘤、腹水型腫瘤和白血病株。在眾多移植性腫瘤中，小鼠Lewis肺癌、小鼠黑色素瘤B16及小鼠白血病P388是目前最受重視和應用最廣的。接種方法（無菌操作）1.實體瘤

制備瘤塊凍存的瘤株

瘤源動物

7~10d

增殖獲得瘤塊移入宿主體內給動物接種受體動物實體瘤接種法：瘤塊接種法、瘤細胞懸液接種法、培養細胞接種法、活細胞接種方法等

瘤塊接種法選取接種后7~10d生長狀態良好的瘤源動物，頸椎脫臼處死，消毒操作部位皮膚。切開皮膚，剝離出接種用的瘤塊，剔除非腫瘤組織和壞死組織，選取生長良好而無變性壞死、淡紅色（黑色素瘤則呈黑色或黑紫色）、魚肉裝的瘤組織，在無菌平皿內剪成2mm3小塊。平皿放置在冰塊上，平皿內放置少許滅菌的PBS或其它營養液。用無菌套管針抽吸瘤塊，接種于同種受體動物腋窩皮下（接種部位皮膚應先消毒）。也可取出腫瘤后切成小塊，在受體動物的腋下剪開一個小口，用無齒眼科鑷夾取瘤塊，送入切口內。腋窩部皮膚松弛，能允許腫瘤生長的較大，宿主動物的壽命也可延長。接種操作的時間盡可能縮短，從瘤塊取材到接種結束一般應在30min內完成。

瘤細胞懸液接種法每次接種的動物數量較多時可采用此法。具體方法是：無菌操作取出瘤塊，將數個瘤塊混合后剪成小塊，放入玻璃勻漿器中，加無菌生理鹽水向一個方向轉動研磨后，經濾網過濾，加生理鹽水稀釋成1:3~1:4（腫瘤g：生理鹽水ml）的瘤細胞懸液，用臺盼蘭染色法計數活細胞數，用1ml注射器注射到接種部位，每個接種點接種0.2ml(一般含1×106~1×107個細胞數）。通常接種到腋窩皮下，每只動物可選用多個接種點。

瘤細胞懸液接種法將對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化脫壁后，用PBS或者生理鹽水以1000r/min離心10min，洗滌2次，洗掉細胞中胰蛋白酶和培養液中血清等成分，用臺盼藍拒染法計數活細胞數，用生理鹽水將腫瘤稀釋成一定濃度的細胞懸液，細胞懸液置于冰上，使用1ml注射器在每個接種點接種0.2ml(含1×106~1×107個細胞),應盡快注射到接種部位。2.腹水瘤腫瘤細胞的凍存與復蘇對腫瘤細胞或瘤株進行冷凍保存可以使其得以長期使用，防止退化或變異，保存不同代細胞的特征。一般在液氮中保存1~2年，細胞存活率可達80%~90%。1.凍存方法：取對數生長期增殖旺盛的細胞，胰蛋白酶消化、離心、洗滌，用含7份培養液、2份小牛血清、1份DMSO配成（1~5）*106個/ml的細胞懸液，轉入細胞凍存管。將凍存管于4℃放置30min,-20℃放置4h，-70℃過夜，然后放入液氮中。2.復蘇方法：取出凍存管，迅速放入38~40℃水浴中，并不停搖動使其在一分內全部融化，500~800r/min離心5min,棄上清，加入培養液，轉入培養瓶內培養。次日更換培養液，以后按常規培養。四.人體腫瘤異種移植性腫瘤模型這種模型使用人的腫瘤細胞，在病理組織形態和遺傳特征等方面均與人類腫瘤相同，用這種模型可以比較直接的研究人類腫瘤的生物學特性及抗腫瘤藥物。常用的宿主動物：裸小鼠和C57BL/6小鼠裸小鼠作為移植宿主實驗動物：在SPF屏障系統內繁殖生長的BALB/c裸小鼠，6~8周齡，體重21~22g。瘤源：來源大致分兩類，一類是人的腫瘤細胞株，另一類是源于人體腫瘤組織快的癌細胞。常用的人癌裸鼠細胞株、接種方法和最佳生長期為:結腸癌HCT-8（勻漿，3周）、胃癌MGC-803(組織塊，4~5周）、肝癌BEL-7402(組織塊，4周）、小細胞肺癌LTEP-SM1(組織塊，4~5周）、乳腺癌MCF-7(組織塊，4~5周）等操作方法（例：人胃腺癌SGC-7901)：1.超凈臺內將移植瘤剪成2~3mm3大小的瘤塊，用套管針接種在BALB/c裸小鼠右側腋窩皮下2.接種24h后隨機分組，開始給予受試藥進行實驗治療，試驗周期6周左右3.停藥次日，稱體重，剝取腫瘤并稱重，計算瘤重抑制率。觀察指標與療效評價：1.動物在接種腫瘤后6周左右形成1g以上的瘤塊（平均瘤重），則表明移植腫瘤成功2.如出現20%小鼠的瘤重小于400mg，則表示腫瘤生長不良3.在藥物治療期間，如給藥組小鼠死亡率超過20%或剝取腫瘤后平均體重下降超過15%（自身對照），表示藥物存在毒性，應當減量重新實驗4.藥效可根據給藥后瘤重抑制率來評價，瘤重抑制率大于30%，并經統計學處理組間差異具有統計學意義時，表示該受試藥有苗頭。重復3次，如療效穩定，評定該藥有一定療效注：腫瘤模型形成時間較長，需30~40d甚至更長。在異種移植瘤實驗中，還有一種正位移植，即將人癌組織或細胞按其在人體內的原發部位，接種于相應的器官，有別于通常的皮下接種（異位接種）免疫功能抑制的大鼠作為移植宿主實驗動物：體重120~160g的Wistar大鼠操作方法（例：人胃癌細胞株）：1.大鼠分籠飼養，皮下注射具有免疫抑制作用的阿糖胞苷200mg/kg體重，2d后用10Gy(1000rad)60Co全身照射，照射后的大鼠飼養于潔凈環境中，每日紫外線燈照射1h，自由攝食飲水，飲水中加土霉素1