分子生物學技術在醫學研究中的應用（基因表達）基因表達

基因表達指基因組中某基因在細胞中轉錄為mRNA和翻譯成蛋白質的過程。基因表達的改變預示著細胞在分子水平上的變化。它往往是細胞形態功能變化之前的變化。DNARNAProtein轉錄翻譯影響基因表達的因素：1、遺傳因素個體差異，終生不變。2、環境因素

激素、藥物，細胞因子、機械刺激、病原體感染、電刺激、細胞轉化…..研究基因表達的手段1、RT-PCR(RNA)2、Northernblot(RNA)3、Westernblot(蛋白質）4、免疫組化（蛋白質）原位雜交、點雜交、RNA酶保護試驗基因芯片1、RT-PCR基本原理：將細胞中mRNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，進行PCR反應。根據PCR產物的量，判斷基因表達的強度。mRNAcDNAPCR產物RT-PCR是一種半定量方法實驗操作：1）RNA提取：Trizol試劑盒。

防止RNA降解RNA提取的成功與否是RT-PCR檢測中最重要的步驟。2)逆轉錄：RNA、緩沖液、dNTP、逆轉錄酶、引物（隨機引物，OligodT)5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNA3)PCR特異性引物、模板、Taq聚合酶。通過PCR，將目的片段擴增幾十—百萬倍。在一定范圍內和一定的條件下，PCR的產物量與模板量呈正比關系。循環次數產物量模板量4）幾個注意問題：反應平臺內參1、PCR效率差異，重復性2、內參選定3、共同擴增4、擴增片段長度5、mRNA豐度，目標片段與內參片段iNOS(誘導型一氧化氮合酶)GAPDH(磷酸甘油醛脫氫酶)5)PCR產物量的測定

應用圖象分析軟件進行密度測定。目標帶密度-背景密度內參帶密度-背景密度=相對量處理后樣品相對量處理前樣品相對量=變化率100%160%ABCD2.02.02.01.02.02.01.01.0RT-PCR特點：優點：靈敏度高、特異性高、操作簡便。缺點：可靠性差、不能細胞定位。2、Northernblot標記探針與膜固相RNA雜交。根據雜交信號強弱判斷表達量，根據雜交信號位置判斷分子長度。雜交信號實驗操作：1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長度RNA)3）轉膜(形成固相RNA)4）探針標記（同位素/非同位素）5）預雜交，雜交6）洗膜7）顯影（放射性/酶促）Northernblot特點：因為沒有擴增過程，Northernblot的結果可靠性高。可以確定未知基因的轉錄產物（mRNA）長度。優點：缺點：1、操作煩瑣2、同位素3、靈敏度低4、對RNA質量要求高5、不能定位細胞3、Westernblot標記抗體與膜固相蛋白作用。根據信號強弱判斷蛋白表達強度。根據信號位置判斷蛋白分子量。標準分子量蛋白特異性反應帶1）蛋白提取2）蛋白電泳（分離不同分子量蛋白）3）轉移4）封閉5）一抗作用6）標記二抗（HRP/AP標記）作用7）顯色實驗操作：Westernblot特點：優點：直接檢測蛋白質的表達量。缺點：靈敏度低一抗制備難度大，購買價格高容易出現交叉反應不能細胞定位4、免疫組化標記抗體與組織細胞作用。根據信號強弱判斷表達強度，根據信號位置判斷表達細胞。eNOS表達（對照）（實驗）實驗操作1）組織切片（石蠟/冰凍）2）封閉，內源性過氧化物酶失活3）一抗作用4）二抗（HRP標記）作用5）顯色6）復染，封片免疫組化特點：優點：細胞定位缺點：定量不準確，人為因素干擾大（圖象分析系統）5、基因芯片特定載體上密集的大量探針與熒光標記的樣品反雜交。根據雜交信號強弱判斷基因表達強度。基因芯片特點：優點：一次雜交可以得到大量表達信息。通用性好。缺點：成本高，需要專門設備。人類基因組計劃揭示了人類有3—4萬個基因，轉錄本多達10萬個。基因不同時