疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)

MolecularBasisofDiseasesFundations

張寶2014.10.141.目錄一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病發(fā)生二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略三、HGP與疾病相關(guān)基因的研究四、生物信息學(xué)主要研究領(lǐng)域2.一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病人類疾病如白血病、惡性腫瘤、糖尿病、心腦血管、高血壓等的發(fā)生發(fā)展涉及到有關(guān)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用的異常。

人體內(nèi)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能的異常是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因。3.一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病細(xì)胞微環(huán)境的變化，包括基因甲基化的變異以及各種特定基因表達(dá)的異常都和疾病發(fā)生有關(guān)。研究顯示基因表達(dá)的異常將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生，尤其是腫瘤形成。4.一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病基因或染色體片段，在精子或卵細(xì)胞形成過程中，會(huì)因某種結(jié)構(gòu)修飾而不能表達(dá)，稱為基因印跡。

生物進(jìn)化中形成的、有規(guī)律而又受控的基因失活是一種重要的調(diào)節(jié)方式。

基因印跡的異常會(huì)導(dǎo)致多種遺傳性疾病。5.6.一、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)異常與疾病發(fā)生（二）細(xì)胞間信號(hào)異常（三）細(xì)胞內(nèi)因素（一）基因的結(jié)構(gòu)改變7.基因結(jié)構(gòu)示意圖8.1.基因突變的多種類型

（1）點(diǎn)突變是單個(gè)堿基的改變（2）缺失是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的丟失（3）插入是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加（4）倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)（5）基因突變還分為配子突變與體細(xì)胞突變（6）動(dòng)態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變

（一）基因結(jié)構(gòu)改變

定義：DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，改變了基因結(jié)構(gòu)。9.1.基因突變的類型

（1）點(diǎn)突變：在基因一級(jí)結(jié)構(gòu)的某個(gè)位點(diǎn)上，一種堿基被另一種堿基取代；

轉(zhuǎn)換（transition）顛換（transversion）10.1.基因突變的類型

（2）缺失（delelation）是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的丟失，一個(gè)或一段核苷酸序列丟失造成的基因結(jié)構(gòu)改變；

（3）插入（insertion）；11.1.基因突變的類型

（4）倒位是一段核苷酸序列方向倒轉(zhuǎn)：基因內(nèi)部的DNA序列重組，使一段DNA序列的方向倒轉(zhuǎn)；（5）配子突變與體細(xì)胞突變；（6）動(dòng)態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷

貝數(shù)隨世代的傳遞而改變。12.

2.基因突變引起的遺傳效應(yīng)a.同義突變(consensemutation)b.錯(cuò)義突變(missensemutation)c.無義突變(nonsensemutation)d.終止密碼子突變或延長突變e.起始密碼子突變(initiationcodonmutation)f.非編碼序列點(diǎn)突變(pointmutationinnoncodingsequence)13.同義突變、錯(cuò)義突變、無義突變、延長突變、起始密碼子突變、非編碼序列點(diǎn)突變14.3.基因突變影響不均一核RNA(hnRNA)的剪接基因突變發(fā)生在hnRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)特定的剪接位點(diǎn)上，導(dǎo)致hnRNA的剪接錯(cuò)誤，產(chǎn)生異常的mRNA，產(chǎn)生異常的蛋白產(chǎn)物，改變生物性狀。15.血紅蛋白結(jié)構(gòu)血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個(gè)α和兩個(gè)β鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個(gè)血紅素。4.結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病血紅蛋白分子一級(jí)結(jié)構(gòu)上的輕微差別；正常成年人血紅蛋白中的β鏈的第六位的谷氨酸殘基被纈氨酸取代就會(huì)導(dǎo)致鐮刀形細(xì)胞貧血病的異常血紅蛋白HbS

的生成。16.血紅蛋白病——鐮刀形細(xì)胞貧血癥17.18.血紅蛋白病類型異常血紅蛋白：珠蛋白結(jié)構(gòu)(質(zhì))變異，導(dǎo)致貧血。

地中海貧血：珠蛋白合成(量)減少，又稱珠蛋白合成障礙性貧血。

19.基因突變類型異常Hb氨基酸變化臨床特征

錯(cuò)義突變

HbShuangfengα27Glu→Lys(GAG→AAG)不穩(wěn)定Hb病

HbSβ6Glu→Val(GAG→GUG)鐮刀型細(xì)胞貧血HbBibbaα136Leu→Pro(CUG→CCA)不穩(wěn)定Hb病

無義突變

HbMckeesRocksβ145Tyr→終止(UAU→UAA)不穩(wěn)定Hb病

終止密碼突變

HbConstantSpringα142UAA→CAAα-地貧(延長：142Gln173UAA)

密碼子缺失

HbGunHillβ91～95缺失不穩(wěn)定Hb病

密碼子插入

HbGradyα118與119間插入3個(gè)氨基酸無明顯癥狀

移碼突變

HbTakβ147UAA→ACUAA不穩(wěn)定Hb病

158UAA(Thr)20.

5.常見單基因病：疾病名稱發(fā)病頻率(‰)遺傳方式致病基因典型癥狀血友病A0.1X連鎖凝血因子Ⅷ不規(guī)則出血血友病B0.03X連鎖凝血因子Ⅸ不規(guī)則出血杜氏肌營養(yǎng)不良0.3X連鎖肌營養(yǎng)因子肌萎縮貝氏肌營養(yǎng)不良0.05X連鎖肌營養(yǎng)因子肌萎縮脆性X綜合征0.5X連鎖FMR1智力障礙舞蹈病0.5常染色體顯性舞蹈病因子癡呆神經(jīng)纖維0.4常染色體顯性NF-1,2癌變珠蛋白生成障礙性貧血0.05常染色體隱性珠蛋白基因簇貧血鐮刀細(xì)胞貧血0.1常染色體隱性β珠蛋白基因貧血,局部缺血苯丙酮酸尿0.1常染色體隱性苯丙氨酸羥基化酶無苯丙酮酸代謝能力囊性纖維化0.4常染色體隱性CFTR進(jìn)行性肺損傷及其他

21.囊性纖維化病22.囊性纖維化病

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTCR)的基因突變所致，產(chǎn)生缺陷型蛋白，致使氯離子的轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，黏液在呼吸道黏膜內(nèi)淤滯，黏膜形成囊性增生，造成呼吸道堵塞；因反復(fù)感染，導(dǎo)致患者呼吸衰竭而死亡。23.GenetherapyofCF

將重組CFTCR基因cDNA-病毒載體，用涂布鼻腔、或噴霧吸入氣管及肺部等方法，轉(zhuǎn)入患者呼吸道上皮細(xì)胞中，獲得正常CFTCR基因的表達(dá)，糾正Cl＋轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，減少黏液分泌。24.（二）細(xì)胞間信號(hào)異常

導(dǎo)致基因表達(dá)變化引起疾病人體各細(xì)胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號(hào)等保持細(xì)胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝。基因表達(dá)也受到細(xì)胞間信號(hào)的調(diào)控。甲胎蛋白（AFP）接受異常的細(xì)胞增殖信號(hào)成為肝癌發(fā)生的重要因素。25.（三）細(xì)胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因表達(dá)異常引起疾病26.二、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略1．通過結(jié)構(gòu)分析確定基因變異PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot分型法、MassArray分型法2．基因表達(dá)水平分析差異顯示、基因表達(dá)芯片、RNA-seq分析3．通過功能學(xué)研究確定致病基因轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、RNAi技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)27.1．通過結(jié)構(gòu)分析確定基因變異PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接測序法、TaqMan探針法SNP分型、SNaPshot法、MassArray法28.（1）單鏈構(gòu)象多態(tài)性

(PCR-SSCP)PCR產(chǎn)物變性后，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率，單個(gè)堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶。29.PCR產(chǎn)物用特異性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，直接在瓊脂糖凝膠電泳上分辨。不同等位基因經(jīng)切割后產(chǎn)生不同長度的DNA片段條帶。（2）限制性片段長度多態(tài)性

(PCR-RFLP)30.RFLPRestrictionFragmentLengthPolyhmorphism31.（3）直接測序法Sanger法雙脫氧核苷酸，ddNTP及熒光標(biāo)記的四個(gè)堿基，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，獲得DNA堿基序列。32.33.（4）TaqMan探針法SNP分型針對染色體上的不同SNP位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)PCR引物和TaqMan探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。探針的5’-端和3’-端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。存在PCR產(chǎn)物時(shí)，產(chǎn)生適合于核酸外切酶活性的底物，從而將探針5’-端連接的熒光分子從探針上切割下來，發(fā)出熒光。通常用于少量SNP位點(diǎn)分析。34.（5）

SNaPshot法測序酶、四種熒光標(biāo)記ddNTP、5’-端不同長度延伸引物和PCR產(chǎn)物模板，引物延伸一個(gè)堿基即終止，經(jīng)檢測后，根據(jù)峰的移動(dòng)位置確定該延伸產(chǎn)物對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，根據(jù)峰的顏色可得知摻入的堿基種類，從而確定該樣本的基因型。通常用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析35.(6)MassArray法MassEXTEND單堿基延伸反應(yīng)，緊挨SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)一段探針，在反應(yīng)體系中以ddNTP替代dNTP，使探針僅在SNP位點(diǎn)處延伸一個(gè)堿基即終止。根據(jù)SNP位點(diǎn)的不同，探針將結(jié)合不同的ddNTP，從而具有不同的分子量，質(zhì)譜儀即可檢測出這種分子量差異，從而實(shí)現(xiàn)SNP分型的目的。36.2．基因表達(dá)水平分析

差異顯示、基因表達(dá)芯片、RNA-seq分析37.（1）差異顯示技術(shù)(mRNAdifferentialdisplayreversetranscriptionchainreaction,DDRT-PCR)在不同的生長時(shí)期、在個(gè)體的發(fā)育與分化的不同階段、在生物體對疾病的反應(yīng)以及不同的環(huán)境下調(diào)控基因的表達(dá)是不同的，這就是基因的差別表達(dá)（differentialexpression）。38.原理：利用兩組特殊的引物對差別表達(dá)的基因進(jìn)行擴(kuò)增。3’端引物：利用mRNA的polyA尾巴設(shè)計(jì)。根據(jù)mRNA結(jié)構(gòu)分析知道，polyA尾巴之前的兩個(gè)堿基只有12種可能的排列組合：根據(jù)這12種排列組合，設(shè)計(jì)12種不同的引物。這些引物由11~12個(gè)T及兩個(gè)其它的堿基組成，用通式5’-T11MN或5’-T12MN表示，M為A、G、C的任一種，N為A、G、C、T的任一種。這種引物稱錨定引物。39.5’端引物：5’端為10個(gè)堿基（10-mer）組成的隨機(jī)引物。每一個(gè)隨機(jī)引物都可能與總mRNA中的某一些分子發(fā)生雜交，雜交位點(diǎn)也可能在mRNA的不同位點(diǎn)上。用3’錨定引物和5’隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增，可獲得50~100條100~500bp的DNA擴(kuò)增帶。為了要尋找更多的DNA差異帶，應(yīng)使用全部的12種錨定引物以及盡可能多的5’隨機(jī)引物。40.41.（2）表達(dá)芯片基因表達(dá)譜芯片是采用cDNA或寡核苷酸片段作探針，固化在芯片上；將待測樣品（處理組）與對照樣品的mRNA以兩種不同的熒光分子進(jìn)行標(biāo)記，然后同時(shí)與芯片進(jìn)行雜交，通過分析兩種樣品與探針雜交的熒光強(qiáng)度的比值，來檢測基因表達(dá)水平的變化。42.43.44.(3)RNA-SeqRNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，就是把mRNA,

smallRNA,

andNONcodingRNA等或者其中一些用高通量測序技術(shù)把它們的序列測出來，分析它們的表達(dá)水平。45.3．通過功能學(xué)研究確定致病基因

轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、RNAi技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá)46.（1）轉(zhuǎn)基因技術(shù)

指在生物基因組中帶有插入或整合入的外源基因，生物個(gè)體能將它傳給后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。47.①顯微注射法：在顯微鏡下，直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。48.②反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染法：把含有重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體病毒顆粒去感染卵裂期胚胎，于是攜帶外源基因的逆轉(zhuǎn)錄DNA可以在感染過程中，整合到宿主細(xì)胞的染色體上。49.③體細(xì)胞核移植，把體細(xì)胞核移入去核卵母細(xì)胞中，使其發(fā)生再程序化并發(fā)育為新的胚胎，這個(gè)胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體。也叫克隆動(dòng)物。50.（2）基因敲除技術(shù)定義：通過一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。①應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除。②利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除③RNA干擾也可以引起基因敲除51.①利用基因同源重組進(jìn)行基因敲除同源重組(homologousrecombination)，又稱基因重組。是最基本的DNA重組方式，通過鏈的斷裂和再連接，在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。52.②利用隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除——基因捕獲法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫，然后通過相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。53.③WhatisRNAi?RNA干擾（RNAinterference，RNAi）內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。54.轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)＋CHSGene矮牽牛花(Jorgensen,R,1990)55.RNA干擾(RNAinterference,RNAi)RNAi是將一段雙鏈的RNA序列導(dǎo)入機(jī)體或細(xì)胞中,機(jī)體或細(xì)胞中與之有同源序列的基因表達(dá)將會(huì)受到抑制,甚至表達(dá)受到完全抑制56.基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎(jiǎng)三位在基因敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，他們是美國鹽湖城猶他州大學(xué)的MarieCapecchi教授、美國北卡羅來納州大學(xué)的Oliversmithies教授以及英國加蒂夫大學(xué)的MartinEvans教授

57.（5）基因誘導(dǎo)超表達(dá)技術(shù)

將目的基因全長序列與高活性啟動(dòng)子或組織特異性啟動(dòng)子融合，經(jīng)過轉(zhuǎn)化后，在誘導(dǎo)劑的作用下或在特定的組織細(xì)胞中，目的基因超表達(dá)，相應(yīng)的基因表達(dá)產(chǎn)物大量積累。比較加入誘導(dǎo)劑前后的表型變化，從而確定目的基因在疾病發(fā)生中的作用。58.三、HGP與疾病相關(guān)基因的研究隨著人類基因組草圖測定的完成，宣告了“后基因組時(shí)代”的到來。功能基因組學(xué)成為研究的重心，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究受到了空前的關(guān)注，也為疾病相關(guān)基因的克隆創(chuàng)造了條件。59.同一種細(xì)胞或組織，處于不同的狀態(tài)（生理與病理等），發(fā)育的不同階段，受到外界的不同影響時(shí)，都可能使細(xì)胞中蛋白質(zhì)的情況產(chǎn)生相應(yīng)的