血栓與止血障礙的實驗診斷

血栓與止血（thrombosisandhemostasis）涉及血管壁、血小板、血液凝固、抗血液凝固、纖溶系統和血液流變學等基礎理論，也涉及上述各方面相應的實驗檢查，為研究和診斷出血性疾病和血栓性疾病所必需。本講就血栓與止血的基礎理論、實驗室檢查和臨床診斷作一簡述。

一、基礎理論

一）血管壁損傷

1．血管壁結構小動脈微循環小靜脈1）內膜層：內皮細胞、基底膜、微纖維。2）中膜層：彈力纖維、平滑肌、膠原。3）外膜層：結締組織。

圖1、圖22．血管壁止血作用（1）促血栓形成血管收縮：自主神經能力增強、內皮素-1。血管性血友病因子（vonWillebrandfactor，vWF）：參與血小板粘附。膠原暴露：誘導血小板聚集和激活因子XII。組織因子（tissuefactor，TF）：參與外源凝血系統。纖溶酶原激活抑制物-1（plasminogenactivatedinhibitor-1，PAI-1）：抑制組織纖溶酶原激活物（t-PA）和（u-PA）。（2）抗血栓形成血管擴張：前列環素（prostacyclin，PGI2）、一氧化氮（nitricoxide，NO）和自主神經能力減低。血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）：與凝血酶結合形成復合物，激活蛋白C系統。肝素類似物：硫酸乙酰肝素軟骨素、抗凝血酶等。

圖3（一）血小板異常1．血小板結構1）膜結構：由血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）和膜磷脂構成2）細胞器：圖4、圖5

致密體顆粒：ADP、ATP、5-HT、纖溶抑制物等。α顆粒：β-血小板球蛋白（β-TG）、血小板第4因子（PF4）、血小板衍生生長因子（PDGF）和凝血酶致敏蛋白（TSP）。3）支架系統：維持血小板形態和血小板收縮活動。微管細絲：肌動蛋白、肌球蛋白4）管道系統開放管道系統（OCS）：是血小板內、外溝通的通道。致密管道系統（DTS）：參與血小板的釋放和代謝。2．血小板的止血作用（1）血小板數量：血小板數維持在（100~300）×109/L，反映血小板生成與消亡之間的動態平衡。數量減少：<100×109/L原發性和繼發性。數量增多：>400×109/L原發性和繼發性。（2）血小板功能：

粘附功能：指血小板與異物的粘附。圖6

聚集功能：指血小板與血小板的粘附。圖7

釋放功能：指血小板內容物分泌至血小板外的反應。促凝活性功能：指血小板第3因子為凝血過程提供催化表面。血塊收縮功能：指血塊回縮功能。圖8

總之，血小板止血功能可歸納于圖9（三）凝血機制1．凝血因子表1。共有14個，經典因子12個，激肽系統2個。除TF外，都存在于血漿；除FIV（Ca2+）外。均為蛋白質。

表12．凝血機制1）經典凝血機制：分內源、外源和共同三條途徑。圖102）修正凝血機制：①TF/FVIIa復合物激活FIXa；②Mg2+參與凝血反應；③組織因子途徑抑制物（TFPI）抑制TF/FVIIa和FXa；④凝血酶激活FXI。圖11(四)抗凝血機制1．抗凝血酶（antithrombin，AT）與肝素結合形成復合物，該復合物滅活凝血酶、FXa、FIXa、FXIa、FXIIa等。

2．蛋白C系統包括蛋白C（PC）、蛋白S（PS）、血栓調節蛋白（TM）和活化蛋白抑制物（APCI）。圖12（五）纖維蛋白溶解（纖溶）系統1．纖溶成分1）激活纖溶成分：組織纖溶酶原激活物（t-PA）、尿激酶型纖溶酶原激活物（u-PA）、因子XIIa、激肽釋放酶（K）、纖溶酶原（PLG）等。2）抑制纖溶成分：纖溶酶原激活抑制物（PAI）和α2-抗纖溶酶（α2-AP）等。2．纖溶激活

在激活物（t-PA、u-PA）的作用下，PLG轉變為纖溶酶（PL）。PL降解纖維蛋白（原）和其他凝血因子的過程。圖13、圖143．纖溶降解

纖維蛋白原的降解產物（FgDP）有碎片X、Y、D和E等；纖維蛋白降解產物有碎片X＇、Y＇、E＇D等。纖維蛋白（原）的降解產物為FDPs。圖15(六)血液流變1．全血粘度、血漿粘度、紅細胞脆性、紅細胞電泳、紅細胞比容、纖維蛋白原、紅細胞沉降率和血漿蛋白等。

2．影響因素較多。二、實驗室檢查

一）常用篩選試驗

1．一期止血缺陷指血管壁和血小板的缺陷。常用篩選試驗如下：1）毛細血管脆性試驗（capillaryresistancetest,CRP）2）出血時間（bleedingtime,BT）

(3)血小板計數（plateletcount,Plt）

(4)血塊收縮試驗(clotretractiontest,CRT)

［原理］［參考值］［臨床意義］［評價］2．二期止血缺陷指凝血機制和抗凝機制缺陷。常用篩選試驗如下：（1）活化的部分凝血活酶時間（activatedpartialthromboplastintime,APTT）圖162）凝血酶原時間（prothrombintime,PT）圖173）纖維蛋白原含量測定（fibrinogen,Fg）圖184）凝血酶時間（thrombintime,TT）［原理］［參考值］［臨床意義］［評價］

圖19、圖203．纖溶系統觀察纖溶活性變化，常用篩選試驗有：1）優球蛋白溶解時間（euglobulinlysistime,ELT）2）纖維蛋白（原）降解產物測定（fibrin(ogen)degradationproducts,FDPs）3）D-二聚體測定（D-dimer,DD）［原理］［參考值］［臨床意義］［評價］（二）診斷試驗1．一期止血缺陷常用診斷試驗表22．二期止血缺陷常用診斷試驗表33．纖溶系統常用診斷試驗表44.血液流變常用診斷試驗表5三、臨床診斷

一）臨床特征1．一期止血缺陷特征1）皮膚、粘膜出血為主，內臟出血少見。2）創口即刻出血難止，持續時間不長。3）壓迫止血有效，止血后不易復發。4）有遺傳性和獲得性。2．二期止血缺陷特征（1）深部組織出血為主，內臟出血常見。（2）創口延遲性出血難止，持續時間較長。3）輸血制品有效，但易復發。4）有遺傳性和獲得性。

3．纖溶活性亢進特征1）皮膚大片狀瘀斑，粘膜、內臟出血。2）創口以滲血為特征，尤其在損傷部位。3）對抗纖溶藥有效。4）多為獲得性。（二）篩選試驗診斷思路1．一期止血缺陷的思路圖21（1）BT和Plt（2）BT和Plt3）BT（N）和Plt（N）4）BT和Plt（N/）2．二期止血缺陷的思路

（1）APTT（N）和PT（N）2）APTT和PT（N）3）APTT（N）和PT4）APTT和PT圖223．纖溶活性亢進的思路1）FDP（-）和DD（-）：纖溶活性正常，見于正常人。2）FDP（+）和DD（+）：纖溶活性亢進，見于DIC、溶栓治療。3）FDP（+）和DD（-）：FDP假陽性，見于肝病等；原發性纖溶活性亢進。4）FDP（-）和DD（+）：FDP假陰性，見于DIC等；DD假陽性。四、臨床應用

（一）血小板功能異常性疾病表6（二）血友病類出血性疾病1.血友?。╤emophilia）表72．血管性血友病（vonWillebranddisease,vWD）表8三）肝臟疾病出血．凝血因子和抗凝蛋白的合成減少．凝血因子和抗凝蛋白的消耗增多．循環抗凝物質和血FDP增多

據報道

診斷肝病時，對觀察病情和判斷預后有價值的指標是：①因子VII：C和II：C減低，先于肝功能異常，可作為肝病早期診斷的指標之一；②Fg和因子V：C減低，反映肝病嚴重，或進入肝硬化；③異常凝血酶原增高是診斷原發性肝癌參考指標之一；④因子VIII：C和vWF：Ag水平越高，反映肝病越嚴重，因子VIII：C降低提示并發DIC；⑤因子XIIIa：Ag、ATIII水平低于35%或PLG的水平低于20%時提示預后不佳；⑥肝病時常呈多個因子的聯合變化，故需綜合分析。（四）血栓前狀態和血栓性疾病的實驗診斷

血栓前狀態（prethromboticstate）也稱血栓前期（prethromboticphase），是指血液有形成分和無形成分的生化和流變學發生某些變化。在這一病理狀態下，血液有可能形成血栓或血栓栓塞性疾病。診斷血栓前狀態和血栓性疾病的實驗可從以下三方面進行。1．篩選試驗①APTT可能縮短；②PT可能縮短；③Fg測定可能增高；④PagT的聚集率可能增高；⑤血液粘度測定一般增高。2．常用診斷試驗

測定血漿中的①vWF：Ag增高反映血管內皮細胞損傷；②β-TG增高反映血小板被激活；③可溶性纖維蛋白復合物單體（SFMC）增高反映凝血酶活性增強或形成增多；④ATIII：A減低反映凝血酶活性增強；⑤FDP和D-D增高反映纖溶酶活性增強。3．特異診斷試驗

測定血漿中①TM和（或）ET-1增高反映血管內皮細胞受損；②P-selectin和（或）11-去氫-血栓烷B2（11-DH-TXB2）增高反映血小板被激活；③F1+2和（或）FPA增高反映凝血酶活性增強或其形成增多；④TF增高反映外源凝血途徑活性增強；⑤TAT增高反映凝血酶活性增強和（或）PC被凝血酶和TM所激活；⑥PAP反映纖溶酶活性增強或形成增多。（五）纖溶活性亢進1．原發性纖溶癥（primaryfibrinolysis）原發性纖溶亢進癥，簡稱原發性纖溶，是由于纖溶酶原激活物（t-PA，u-PA）增多導致纖溶酶活性增強，后者降解血漿纖維蛋白原和多種凝血因子。2．繼發性纖溶癥(secondfibrinolysis)

主要見于彌散性血管內凝血（DIC）。DIC時，由于因子XIIa、激肽釋放酶（K）、凝血酶等增多導致纖溶酶增多或活性增強，后者降解血漿纖維蛋白（原）和多個凝血因子。DIC的實驗室診斷，同時有下列三項以上異常者：①Plt低于100×109/L或進行性下降；②血漿Fg低于1.5g/L；③PT縮短或延長3s以上或呈動態變化；④3P試驗陽性或FDP超過20mg/L。此外，PLG含量或活性降低、AT含量或活性降低、血漿因子VIII：C低于50%都有助于疑難病例的診斷。表9

近年來，DIC前期（pre-DIC）提出的指標是：F1+2、TAT、PAP、D-D等四項，其中二項或二項以上陽性便可診斷。（六）抗栓治療的監測1．普通肝素的監測選用APTT監測，使APTT值維持在正常對照的1.5~2.5倍或選用uFH血漿濃度測定，使其維持在0.2~0.4IU/ml。但在體外循環應用uFH抗凝時，可選用活化的凝血時間（activatedclottingtime,ACT），參考值為60~120秒，使其維持在350~450秒為宜。2．口服抗凝劑的監測首先選用血漿凝血酶遠時間比率（PTR），使其維持在1.5~2.0為佳。必要時，選用國際標準化比率（internationalnormalizedratio,INR），中國人一般維持在1.5~2.5之間為宜。

3．溶栓治療的監測

可選用Fg、TT、FDP作為實驗室監測指標。目前多數學者認為維持在Fg在1.2~1.5g/L,TT在正常對照的1.5~2.5倍,FDP在300~400μg/L最為適宜。主要參考文獻1］陳文彬、王友赤主編.診斷學.第五版.北京:人民衛生出版社.20012］胡翊群、王鴻利、熊樹民等主編.現代血液學與臨床實踐.上海:上?？萍嘉墨I出版社.1999［3］ColmanRW,HirshJ,MarderVJ,etal(eds).Hemostasisandthrombosis:Basicprinciplesandclinicalpractice.3rded.Philadelphia:J.B.LippincittCompany.1994復習思考題、名詞解釋1．凝血機制2．纖溶系統3．蛋白C系統4．血管壁止血功能二、問答題1．簡述血栓與止血各篩選試驗的原理、參考值和臨床意義。2．如何組合篩選試驗？簡述他們的臨床應用。3．簡述DIC的實驗室檢查和診斷。一、貧血的概念外周血中單位容積內紅細胞計數、血紅蛋白含量或紅細胞比容（Hct）低于正常下限。二、貧血的分類1.形態學分類(1)按MCV、MCH、MCHC分紅細胞比容(hematocrit,Hct)紅細胞在血液中所占容積的比值正常值：男0.42~0.49L/L(42~49%)

女0.37~0.48L/L(37~48%)平均紅細胞體積(meancorpuscularvolume,MCV)每個紅細胞的平均體積MCV=Hct/RBC(L)×1015(fl)正常值：80-94fl（1ml=1012fl）平均紅細胞血紅蛋白含量（meancorpuscularhemoglobin,MCH）每個紅細胞內所含Hb的平均量MCH=Hb/RBC(g)×1012(pg)

正常值：26-32pg（1g=1012pg）平均紅細胞血紅蛋白濃度（meancorpuscularhemoglobinconcentration,MCHC）每升紅細胞中平均所含Hb濃度MCHC=Hb/Hct(g/L或%)正常值：310~350g/L或31%-35%貧血的形態學分類類型MCV(fl)MCH(pg)MCHC(%)病因大細胞性貧血>100>3231-35巨幼貧等正常細胞性貧血80-9426-3231-35再障等小細胞低色素性<80<26<30缺鐵貧等貧血單純小細胞性<80<2631-35慢性感染、貧血炎癥等2.按RDW和MCV分類RDW：紅細胞容積分布寬度(redbloodcellvolumedistributionwidth)，反映外周血紅細胞異質性的參數即紅細胞大小均一程度。正常值：11.5%-14.5%根據MCV和RDW確定貧血類型RDWMCV

正常增加（大細胞）

降低（小細胞）

正常急性失血、MDS輕型海洋性貧血尿毒癥、遺球、

肝病

酶缺陷性溶貧增加缺鐵早期、MF、巨幼貧缺鐵貧

免疫性溶貧MDS化療后3.病因學分類（1）紅細胞生成減少骨髓造血功能障礙：AA、繼發性貧血、骨髓病性貧血造血原料缺乏或利用障礙：缺鐵貧、巨幼貧、鐵粒幼貧紅細胞分化成熟障礙：真紅（骨髓衰竭期）、MF、PNH、ANLL-M6、早期紅白細胞貧血（Leuko-erythroblasticanemia）

（2）紅細胞破壞增加紅細胞內部因素：膜、酶、蛋白（多為先天性/遺傳性）紅細胞外部因素：藥物、感染、免疫、機械因素（3）失血急性：24h~48h內失血800~1000ml慢性：潰瘍、月經紊亂等4.骨髓增生程度

（僅適用于國內）增生性貧血：缺鐵貧、溶貧、巨幼貧（幼紅細胞≥20%）增生低下性貧血：再障、純紅再障（幼紅細胞<10%）三、貧血的臨床表現一般癥狀呼吸循環系統泌尿生殖系統消化系統四、貧血的檢查(一)貧血的確定

RBC(×1012/L)Hb(g/L)Hct(L/L)男性<4.0~4.5<120<0.4女性<3.5~4.0<110<0.35孕婦<100（二）貧血程度的判定

程度Hb值（g/L）

癥狀

輕度91~正常值下限癥狀輕微中度61~90活動后心悸、氣促重度31~60休息時也有心悸、氣促極重度<30常合并貧血性心臟?。ㄈ┐_定貧血類型MCV、MCH、MCHCRDW血涂片檢查（四）幫助診斷貧血類型的檢查1.網織紅細胞(reticulocyte)計數干細胞→晚幼紅細胞→網織紅細胞→成熟紅細胞正常值：百分比法0.5~1.5%絕對計數法（24~84）×109/L*糾正值法（22~74）×109/L病人RBC百萬數*糾正值=網織絕對值×4.5意義：反映骨髓造血功能觀察療效（治療性試驗）病情觀察的指標2.骨髓檢查缺鐵性貧血血象：1:中幼紅細胞2：晚幼紅細胞

IDA骨髓病理正常骨髓外鐵

外鐵（-）~（±）：（+）~（++）：

IDA紅細胞掃描電鏡圖像：巨幼細胞貧血血象巨幼細胞貧血骨髓象巨幼細胞貧血骨髓象溶血性貧血

Hemolyticanemia一、定義由于各種原因使紅細胞壽命縮短，過早、過多破壞，超過骨髓造血代償能力引起的貧血。二、分類

（一）按發病機制分1.RBC內在因素（遺傳性/先天性）RBC膜缺陷：遺球、遺橢、（PNH）RBC酶缺陷：G6PD缺陷、PK缺陷珠蛋白異常（肽鏈不平衡）：α-地貧、β-地貧、不穩定Hb病2.

RBC外在因素（獲得性）免疫性溶貧機械損傷性：DIC、TTP感染：瘧疾物理因素：灼傷毒素：蛇毒脾亢(二)按溶血發生部位分

（RBC破壞場所）血管內溶血：RBC在血管內破壞，見于DIC、機械性微血管病變、燒傷、輸血血管外溶血：RBC在單核-吞噬細胞系統吞噬或破壞三、Hb的分解代謝在單核-吞噬系統內進行RBC破壞釋放出Hb游離Hb→未結合膽紅素→結合膽紅素→尿（糞）膽原→尿（糞）膽素四、溶血后發生的病生變化RBC破壞增加所致變化（見表）血管內溶血

游離Hb

血漿結合珠蛋白血結素高鐵血紅蛋白腎含鐵血黃素肝血白蛋白Hb尿含鐵血黃素尿分解高鐵血紅素白蛋白復合物RBC代償性增生——骨髓造血功能亢進、網織紅細胞增加、血片中RBC偏大、多色性RBC增加、出現幼紅細胞五、臨床表現貧血、黃疸、脾腫大急性：血管內溶血引起，發熱、畏寒，可出現Hb尿，腎功能改變慢性：血管外溶血引起，無發熱、畏寒及Hb尿，肝脾腫大，免疫指標異常，膽紅素代謝異常，骨髓代償性造血活躍。六、實驗室檢查

（一）確定溶血的檢查

1.顯示紅細胞破壞增加的依據（1）RBC壽命測定（最佳）正常值：25~32天51Cr同位素標記，半衰期<15天，說明有溶血存在。（2）紅細胞形態改變破碎紅細胞、盔形紅細胞等紅細胞碎片左：盔形、三角形、棘形、碎片等右：人工造成的皺縮紅細胞

（涂片太厚、天氣濕熱、玻片帶堿性）（3）血清乳酸脫氫酶活性

（LD）測定（敏感）正常值：80U~250U/L升高為RBC破壞指標（>600U/L）

（4）血漿游離Hb測定（plasmfreehemoglobin）正常值：<40mg/L意義：血管內溶血的指征（5）血清結合珠蛋白

（haptoglobin,Hp）測定正常值：0.5~2.2g/L溶血存在時，Hp減少。（6）血漿高鐵血紅素白蛋白試驗

（methemalbumintest）正常：陰性嚴重血管內溶血時呈陽性（7）Hb尿測定（hemoglobinuria）血管內有大量紅細胞破壞，血漿中的游離Hb量超過1000mg/L時出現正常值：陰性溶血時陽性（8）尿含鐵血黃素試驗

（Roustest)正常值：陰性溶貧中陽性只占10~20%2.顯示RBC代償性增生的依據血象見圖網織紅細胞計數（無特異性）正常：0.5~1.5%,絕對值（20~85）×109/L溶貧時達5~25%甚至75%以上。骨髓象

下一張多色性紅細胞Howell-Jolly小體Cabot環嗜堿點彩紅細胞

返回（二）確定溶血病因的檢查1.紅細胞膜缺陷的檢驗(1)RBC滲透脆性試驗(erythrocyteosmoticfragilitytest)檢測紅細胞在不同濃度低滲NaCl溶液中的抵抗力，即檢測紅細胞滲透脆性。RBC表面積/RBC容積比值與RBC脆性成反比。

正常值：開始溶血0.42%~0.46%(NaCl液)完全溶血0.28%~0.32%(NaCl液)膜缺陷性溶貧，RBC脆性增加脆性孵育試驗(incubatedosmoticfragilitytest)：溶血率增加，中間脆性>0.6%(NaCl液)輕型遺球：脆性正常，脆性孵育增加。

(2)自身溶血試驗及其糾正試驗

（autohemolysisandcorrectiontest）正常人紅細胞經孵育48h后，溶血率很低<4.0%，加葡萄糖或ATP后更低（<0.6%）G6PD缺陷：＋ATP：可糾正但不能糾至正常＋G：同上PK缺陷：＋ATP：可糾正＋G：不糾正

（3）酸溶血試驗（Hamtest）

（acidserumhemolysistest）特異性高，是國內外公認的PNH確診試驗利用補體在弱酸性環境中激活，并攻擊RBC膜，致溶血。受檢者RBC+正常血清（補體）溶血（+）稀HCl37℃30min說明受檢者RBC對補體敏感性很高。

（4）蔗糖溶血試驗

（sucroselysistest）特異性敏感性均不如Ham試驗，僅做篩選。參考值：陰性2.酶缺陷的檢驗（1）自身溶血試驗及其糾正試驗（2）變性珠蛋白小體生成試驗受檢RBC＋乙酰苯肼作活體染色（甲基紫）37℃1~2h有變性珠蛋白小體，則膜上形成紫黑色顆粒結果：此類細胞>5%即（＋），正常人<30%意義：不穩定Hb也可出現，故僅作篩選見圖

下一張

返回（3）高鐵血紅蛋白還原試驗（methemoglobinreductiontest）正常值：定性法（－）半定量法還原率>75%G6PD缺陷—定性（＋），半定量<70%。

G6PD高鐵血紅蛋白還原酶G6PNADP還原型美蘭HbFe3+6PGNADPH氧化型美蘭HbFe2+NaNO2（4）氰化物-抗壞血酸試驗

（ascorbatecyanidetest）結果：正常血液幾小時后變暗色意義：G6PD缺乏者血液變成棕色（巧克力色），純合子在2h內即變色，雜合子要3~4h變化（5）酶活性測定

G6PDPKG6PD活性測定（紫外分光光度法）敏感性高，準確性高，確診試驗正常值：2.8~7.3U/gHb.min意義：G6PD缺陷，干細胞病時活性降低。PK活性測定（紫外分光光度法）確診試驗正常值：10~20U/gHb.min意義：降低見于PK缺陷癥，造血干細胞疾病3.珠蛋白合成異常的檢驗血紅蛋白的結構

原卟啉

血紅素Hb（四聚體）鐵

2條α鏈

珠蛋白：由4條多肽鏈組成

2條非α鏈正常血紅蛋白的種類類型肽鏈所占比例HbAα2β2

正常成人>95%HbFα2γ2正常成人<2%

為胎兒期Hb主要成分HbA2α2δ2正常成人2%-3%（1）細胞形態學檢查Wright染色：小細胞低色素性，靶形紅細胞易見見圖

靶形紅細胞（targetcell）HbF酸洗脫法測定HbF抗酸能力較HbA強，在酸性緩沖液中保濕一定時間，只有含HbF的紅細胞不被洗脫，再用伊紅染色呈鮮紅色成人陽性小于1%，地中海貧血患者陽性紅細胞增多HbH包涵體生成試驗（HbHinclusions）參考值0~5%意義：HbH病者陽性紅細胞可達50%以上（2）血紅蛋白電泳分析主要檢查有無異常Hb區帶在HbA前出現——快速異常：HbH，J，K組在HbA后出現——慢速異常：HbG，D，E組HbA2定量測定正常值：1.5~3%>5%為升高（3）HbF定量測定（堿變性試驗）HbF具抗堿作用正常值：成人<2%，新生兒55%~85%，1歲左右同成人>4%為升高，主要見于β地中海貧血（4）異丙醇沉淀試驗正常人Hb40min后開始沉淀。有不穩定血紅蛋白存在，10min內出現混濁沉淀。

HbF、H、E、α-地貧雜合子、G6PD缺陷，也可假陽性。

4.免疫性溶血的檢驗抗人球蛋白試驗（Coombs`test）為檢查溫抗體（不完全抗體）敏感的試驗主要用于診斷AIHA(autoimmunehemolyticanemia)直接抗人球蛋白試驗（DAGT）

測RBC表面結合的抗體（更重要，價值高）受檢者RBC懸液+等量抗人球蛋白試劑低速離心后觀察凝集否37℃，15min

如病人RBC膜上有IgG型抗體或C3d抗體則出現凝集反應（+）抗人球蛋白試劑內有抗IgG抗體，抗C3d抗體（抗抗體）陽性反應條件：結合在RBC膜上自身抗體（100~500分子數/RBC），分子數過少致假陰性。間接法（IAGT）：測游離特異的抗體（先使RBC致敏，再與抗人球蛋白血清結合）將病人血清和正常RBC混合，再加入抗IgG試劑病人血清RBC抗IgG分析細胞學FALSSensorLaser細胞的形態學參數生物學特征細胞化學成分及含量細胞的功能定量分析細胞學年青的交叉學科

激光技術數字計算機技術電子物理技術電子攝像技術光電測量技術熒光細胞化學技術單克隆抗體技術等FCMHistory1934Moldavanlfirsttry（從固定式細胞分析-流動式）1953Crosland-Taylor:laminarflow（解決難題）1956Coulter（初次應用）1965Kamentsky:spectrometerprinciple(Ortho（開拓）1967VandillaandLosAlamosgroup:Feulgen,DNAHistogram（完善）1969Hulett:Sorter(Icp-22)1973B-D:FirstcommercialFCM--FACSI（發展）1979SSMU:FCMDeveloping（推廣）1980BJNU:FirstFCM(FACSIII)inChinaAbout450FCMsinChina1979年國家科委重點項目：研制國內第一臺激光流式細胞儀1982年國內第一臺三參數激光流式細胞儀誕生1984年國家科委組織科研成果的鑒定驗收1985年獲國家衛生部科技成果乙等獎1985年--1990年靈敏度、信噪比、更多參數流式分選儀研制開發計算機四參數軟件樣品制備、醫學生物學應用BD公司不同型號流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSAriaFACSCountFACSVantage&DiVaFACSCantoCoulter公司不同型號流式細胞儀EPICSXL/XL-MCL

臺式機

CytomicsTMFC500系列最新型EPICSAltra細胞分選儀大型科研型

什么是流式細胞術(FCM)？

FCM是以流式細胞儀為檢測手段的一項能快速、精確的對單個細胞理化特性進行多參數定量分析和分選的技術。FALSSensorLaser特點:

流動的可以是活細胞的定量的多參數的高統計學精度的分選細胞

FCM的一般結構和原理速度軌跡檢測散射光熒光InjectorTip熒光信號激光束Sheathfluid流動室2-3mm方形石英內徑直200-300

m

流速慢,細胞信號大,小型化。通過流動室后細胞一個一個排列成單行,依次通過檢測區.把流動室稱為單細胞流發生器.流動室LaserFlowCell孔徑50-200

m

檢測區離噴口200

m有分選功能液流驅動系統（示意圖）流速與壓力的關系服從Bernoulli方程，即P=(1/2)V2

(忽略高度的變化)。改變氣壓,就可獲得不同的流速。

FACSVantageFluidSystem激光（Laser,Lightamplificationbystimulatedemissionofradiation)是一種相干光源。單譜線，高強度.

細胞在1-2us內就可以收集到足夠強的熒光信號.一般采用Ar+激光器,有多條可調譜線,與多種熒光染料激發譜匹配.激發光源與光束成形系統

球透鏡和柱面透鏡：20×200

m

橢圓形光，短軸和細胞流平行，長軸與細胞流垂直。光束成形與細胞受照方式激發光焦斑這種橢圓形光斑的檢測區保證每個細胞分別受到光照且受檢時受到一致的光照

FCM的單細胞照明技術.光束成形與細胞受照方式低速高速

不同樣本速率形成的樣本流

LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統：濾光片信號轉換系統:光電數字信號.FCM細胞分選裝置488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFSCSensorFluorescencedetector

超聲振蕩器:20-40KC液流斷離點:離噴口5-8mmf=v/4.5d液滴沖電:脈沖幅度,荷電多少,寬度大小同時帶電液滴數多少.靜電高壓偏轉板:幾千伏電壓分選細胞的收集裝置:96孔板,載玻片或試管利用單克隆抗體分離細胞亞群陽性選擇陰性選擇MACS-MagneticCellSorting磁珠分離通道式分選電荷式分選細胞分選系統PMTPMTPMTPMTDichroicFiltersBandpassFiltersLaser1234Flowcell

細胞信號檢測與分析處理系統光電管細胞散色光的波長是與激發光波長一致的.前向散色光信號:光電二極管側向及熒光信號用光電倍增管PMT可將散色光及熒光信號轉換成電脈沖信號,電脈沖信號通過模數轉換器(ADC)量化為數字信號.FALSSensorLaserForwardAngleLightScatter(FSC)細胞散色光信號細胞對光的散色現象與細胞樣品制備無關.90DegreeLightScatter(SSC)FALSSensor90LSSensorLaser細胞對光的散色現象與細胞樣品制備無關.FSCFSC信號的強弱與細胞的大小和活力相關SSCSSC信號的強弱與細胞內顆粒多少相關細胞散色光信號細胞熒光測量細胞的自發熒光未經染色的樣品細胞在激發光的照射下可測到有微弱的熒光信號.細胞熒光

經過各種特異染色的細胞在激發光的照射下可測到較強的熒光信號.自發熒光信號與特異染色的熒光信號分析圖自發熒光信號特異染色的熒光信號細胞熒光信號AMPAMP

經過PMT將光學信號轉變為電脈沖信號，并增加PMT的電壓及增益，可將脈沖信號進行放大。放大方式有兩種：線性放大(Lin):對數放大(Log):熒光信號的測量：

熒光檢測器檢測特定熒光的特定發射波長

線性放大對數放大細胞熒光信號熒光光譜重疊

FITC和PE熒光光譜重疊

UncompensatedvsCompensatedFL1FL2利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的信號加以扣除的技術稱“熒光補償”熒光補償FCM測量數據的存貯、顯示和分析（一）FCM數據的存貯（二）FCM數據的顯示方式（一）FCM數據的存貯

ListMode方式就是用表格的方式將每一個被測細胞的眾多原始測量數據全部記錄下來，成為一個數據文件。1.單參數直方圖（Histogram）2.雙參數數據顯示：

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

二維密度圖(DensityPlot)

假三維圖(Pseudo3DPlot)3.三維圖(3DPlot)（二）FCM數據的顯示方式１.單參數直方圖的顯示

以分布直方圖(distributionhistogram)來顯示，橫軸為該參數測量強度相對值，單位是道數。強度分布可以是線性的，也可以是對數的?？v軸一般是細胞數或細胞出現的頻數。Single-ParameterHistogramDisplays單參數直方圖的顯示２.雙參數數據的顯示

細胞雙參數測定不僅能提供二個參數各自與細胞數量的關系，更重要的是獲得了這二參數之間的相關關系，其中包含了更多的生物學信息。雙參數數據顯示最常用的是二維的散點圖(DotPlot)。在二維圖上，X軸代表第一個測量參數，Y軸代表第二個測量參數。每個點代表一個細胞.Two-ParameterDataDisplays點圖(dotplot)二維等高圖

用等高線來表示細胞數，在一條等高線上細胞數相同，不同的等高線上細胞數不同。假三維等高圖

縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數,Z軸為細胞數。３.多參數數據的顯示

在單一圖上同時顯示多參數是不可能的。實際工作中是用若干個單參數直方圖和各種不同組合的雙參數數據顯示來反映各種信息的。多參數測量另一重要意義是通過有關參數進行“設門”分析(gatinganalysis)可以是單參數設門，也可以是雙參數設門。單參數設門調出雙參數顯示簡稱“一調二”。不難理解也有“一調一”和“二調一”和“二調二”等。Multiple-ParameterDataDisplays多參數直方圖

三維坐標勻為參數（散射光或熒光）而非細胞數。多參數顯示

一般利用所得參數的兩兩組合并利用設門（Gate)技術，來分析參數之間的相互關系。Pseudo3DPlot3DPlot多參數顯示通過雙參數調閱單參數通過單參數調閱雙參數１.單參數分布直方圖的設區分析２.細胞DNA含量分布直方圖的數據分析３.雙參數數據的設門分區分析４.多參數數據的分析FCM數據的分析１.單參數分布直方圖的設區分析細胞DNA含量分布直方圖的數據分析細胞DNA含量分布直方圖的數據分析DNA分析比較

縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參數,在圖中每一個點代表一個細胞雙參數數據的設門分區分析雙參數數據的設門分區分析正常造血細胞分化成熟的抗原表達

正常造血細胞不同階段的抗原表達是受一系列基因嚴密控制的,在一定的分化階段哪些抗原表達上調、哪些抗原表達下調及抗原表達量多少存在著明顯的規律性.一部分白血病細胞反映了這種分化模式,但白血病細胞經常出現異常的抗原表達模式.這些異常的抗原表達模式可以作為診斷白血病的有用指標,也可以作為檢測殘存白血病的重要指標.FCM白血病細胞免疫表型診斷I:粒細胞表達CD34HLA-DRCD13CD45較高水平的CD33,不表達成熟標志.II:CD34HLA-DR下調變為陰性,CD15高表達CD33輕度減低,CD13/CD45不變.III:出現中水平CD11b,CD13減弱,CD33與II相同,CD45陽性.IV:CD13增強,出現CD10,CD33進一步減低.CD11b和CD15表達增強.V:CD11b、

CD13、

CD45表達最強,CD15陽性,CD33弱陽性.分選出:I為原粒細胞II早幼粒細胞III中幼粒細胞IV晚幼粒細胞V中性分葉核粒細胞分選出:I原單核細胞II幼單核細胞III成熟單核細胞I:表達中等程度的CD34CD13CD45CD33和HLA-DR.與原粒細胞不能區分.II:CD11b快速上調,CD13CD33增加,CD45保持中等水平.HLA-DR減弱,仍為陽性.III:CD14快速上調,CD45也增加.CD13CD33HLA-DR陽性.成熟粒細胞與單核細胞HLA-DR表達不同,前者為陰性,后者為陽性:CD14在成熟單核細胞為陽性,而粒細胞為陰性.分選出:I原始B淋巴細胞II胞質IgM陽性IIIFMC7及表面IgM也在此期出現I:原始B細胞，表達CD34HLA-DRTdTCD10高表達，CD19CD45CD22較弱.II:CD19CD45量增加,CD10量減少.CD34TdT變陰性.CD20開始表達,CD22強度不變,仍較弱.III:CD20CD45到最大,CD10至陰性.CD5陽性.可以CD5CD10同時陽性.IV:出現CD23CD22強度增加.CD5消失,CD19CD45保持高水平.CD20強度輕度減低I:CD7CD10高表達,CD3陰性.CD1a增加.1/3細胞表達CD34,并表達CD2CD5.II:抗原表達與III期相似,但細胞體積較III大.在小鼠胸腺內,相當于皮質淋巴細胞.CD1aCD45表達量增加.出現CD4+/CD8+細胞,CD7強度減低.III:出現CD3表達,其他抗原同II,但細胞體積變小.IV:出現CD3CD7強度最大,CD1a變為陰性.CD4與CD8變為單陽細胞.CD2CD5持續陽性.幼稚白血病細胞的表型分析淋巴細胞(R2)、粒細胞(R4)、異常幼稚細胞(R3)、單核細胞(R5)和有核紅細胞(R6)分開、FSC/SSC圖顯示綠色(R2)、紅色(R3)、灰色(R6)細胞有重疊，難以在此圖中將幼稚細胞與淋巴細胞、有核紅細胞分開R2.淋巴細胞;R3.中、晚幼粒細胞;R4.中性粒細胞;R5.單核細胞;R6.嗜酸、嗜堿性細胞;R7.幼淋巴細胞;R8.幼稚髓細胞;R9.有核紅細胞一.血液與血細胞的

起源血液是一種流體組織/體內不斷循環

細胞外液的4/5在血管外組織液

1/5在血管內血液

血液是內環境中最活躍的部分,溝通各種組織液/物質交換的中間環節血液的組成

血漿:晶體物質溶液:

水,電解質,小分子有機物血漿蛋白:

白蛋白,球蛋白,纖維蛋白原血細胞:紅細胞白細胞血小板血漿蛋白的作用1.營養功能2.運輸功能3.緩沖功能4.形成膠體滲透壓5.參與機體的免疫功能6.參與凝血和抗凝血功能血液的理化特性

血液的比重與紅細胞懸浮穩定性比重:全血1.050-1.060/血漿1.025-1.030紅細胞懸浮穩定性:

紅細胞比重大于血漿,但其沉降緩慢

紅細胞沉降率(血沉):

紅細胞在一小時內下沉的距離正常男性小于3mm/h，女性10mm/h

血沉加快,紅細胞疊連增多如:球蛋白或纖維蛋白原增多血沉減慢,如白細胞增多時(血液的粘滯性粘滯性值血液/4-5；血漿/1.6-2.4

粘滯性大小和紅細胞數目/血漿蛋白含量有關疾病時，微循環血流減慢，紅細胞疊連聚集粘滯性增大，血流阻力加大

血漿滲透壓313mOsm/kgH2O

晶體滲透壓:來自于血漿中晶體物質/小分子,可出入血管膠體滲透壓:血漿蛋白產生1.5mOsm/kgH2O,不透過毛細血管血漿的pH值人血漿7.35-7.45

波動范圍小，由血漿NaHCO3/H2CO3等緩沖3類血細胞

紅細胞/白細胞/血小板

均來源于造血干細胞(一)胚胎期造血器官中胚葉造血期肝臟造血期骨髓造血期出生前的造血部位

卵黃囊骨髓

肝臟

脾淋巴結

12345678910月(二)出生后的造血器官髓外造血骨髓造血的變化二.血細胞分化和成熟分化的定義血細胞的分化細胞的增殖分裂細胞形態演變的一般規律造血干細胞stemcell

全能干細胞多能干細胞集落形成單位colonyformingunit

脾集落形成單位CFU-S

細胞集落形成單位CFU-C造血祖細胞hematopieticprogenitorcell原始細胞幼稚細胞血細胞分化過程全能干細胞

多能干細胞階段

祖細胞階段

階段

1.BFU-E

髓系

2.CFU-GM全能干細胞

3.CFU-EO

4.CFU-Meg

CFU-TL

淋巴系

CFU-BL

造血干細胞骨髓干細胞淋巴干細胞原紅原粒原單原巨原淋早幼紅早幼粒幼單幼巨幼淋中幼紅中幼粒顆粒巨

晚幼紅晚幼粒單核細胞淋巴細胞網織紅細胞桿狀核產板巨紅細胞分葉核血小板返回血細胞分裂增殖

分裂象返回血細胞形態演變的一般規律（原始-幼稚-成熟）細胞體積大小（早幼粒大于原粒，巨核細胞由小到大）細胞核大小核形圓凹陷分葉核漿比大小核染色質結構細致、疏松粗糙、緊密核仁有無胞漿少多（淋巴除外）胞漿顏色藍淡藍、紅胞漿顆粒無有粒細胞發育

原粒早幼粒中幼粒

晚幼粒桿狀核分葉核血液組織三.造血的調控造血微環境的調控1.造血微環境2.調控造血細胞生長因子1.紅細胞生成素erythropoietin,Epo2.集落刺激因子colonystimulatingfactor,CSF3.巨核細胞集落刺激因子白細胞介素的作用造血細胞生長因子和白介素的調空____________________________________SCEMegNEoBAMBLTLIL-1+(+)(+)(+)(+)-(+)++IL-2-------+++IL-3++++++++--IL-4-(+)(+)(+)(+)++-++IL-5----++--+++-IL-6全髓增殖因子IL-11全髓增殖因子GM-CSF++++++-+--G-CSF（+）（+）（+）++--+--M-CSF++--EPO-++-------TPO巨核系________________________________________________________紅細胞生理

1.紅細胞的數量、形態和功能數量:男性:500萬個/μl

女性:420萬個/μl

形態:雙凹圓碟/盤形，表面積/體積比值大增加氣體透過面積/變形能力功能:主要為結合和攜帶氧

2.紅細胞比容紅細胞在血液中所占的容積百分比男40-50%/女37-48%生成紅細胞所需的物質

主要：VitB12,葉酸,鐵

VitB12--含鈷有機物，與胃腺壁細胞分泌的內因子結合成復合物，入血后由轉鈷蛋白結合運輸到造血組織/內因子是核蛋白合成的輔酶缺乏時核漿發育不平衡/巨幼紅細胞性貧血葉酸--合成細胞核的DNA酶的輔酶

缺乏時導致貧血/產生大量胞漿不足小紅細胞鐵--合成血紅蛋白的原料缺乏時引起小細胞性貧血紅細胞生成的調節人體內2.5*1012紅細胞，24小時0.8%更新每分鐘生成1.60*108個紅細胞爆式促進因子/BPA

促進造血干細胞向紅系祖細胞分化增殖促紅細胞生成素促進較晚期紅系祖細胞向前體細胞分化/加速細胞增殖生長素、甲狀腺激素等及雄激素，增強促紅素作用白細胞生理

有核，4000-10000/μl，炎癥時增多，粒/單核/淋巴；分化與增殖受一組造血生長因子調節/集落刺激因子6種粒細胞：60%,細胞質內具有顆粒中性粒細胞/嗜堿性粒細胞/嗜酸性粒細胞中性粒細胞:

占絕大多數/血管內6-8小時后進入組織參與非特異性細胞免疫/含大量溶酶體酶嗜堿性粒細胞:

占白細胞的0.5-1%，顆粒為肝素和組織胺釋放的肝素增強脂酶活性，參與脂肪代謝釋放的組織胺與過敏反應的癥狀有關

嗜酸性粒細胞:

占白細胞的2-4%，限制嗜堿粒細胞在過敏反應中的作用使局部聚集/通過釋放活性物質以限制其活性參與對蠕蟲的免疫反應單核細胞:

白細胞總數的

8-9%，15-30μm/胞體大出骨髓入血時未成熟，2-3天遷入組織增大成熟

此即組織巨噬細胞/存在淋巴結、肝、脾等

具更多非特異性脂酶/更強的吞噬作用淋巴細胞：

特異性免疫反應細胞，B細胞/T細胞2大類血液和淋巴結、脾臟淋巴系干細胞發育而來生長成熟受白細胞介素等細胞因子調節