中國(guó)漢族人食管鱗狀細(xì)胞癌

易感基因定位研究

周福有王立東

河南省安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科河南省食管癌重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室2010.10.31鄭州河南省林縣、安陽、新鄉(xiāng)等顯著的地域分布差異

食管癌是世界上最常見的六大惡性腫瘤之一，每年死亡30萬人，也是中國(guó)最常見的惡性腫瘤，排在中國(guó)惡性腫瘤死因的第四位有顯著的地域分布特征，高低發(fā)區(qū)發(fā)病率相差高達(dá)500倍楊氏家族家庭成員:23,食管癌患者:15(65%)明顯的家族聚集現(xiàn)象高癌家族林縣1965年高癌家族林縣2007年環(huán)境因素復(fù)雜遺傳因素明顯食管癌的病因尚不清楚

遺傳因素？

環(huán)境因素？問題：遺傳因素和環(huán)境因素究竟孰重孰輕？相互之間如何起作用？單基因遺傳病單基因遺傳病是指單一基因突變引起的疾病符合孟德爾遺傳方式，所以稱孟德爾式遺傳病多基因遺傳病多基因遺傳病是由多個(gè)微效基因與環(huán)境因素共同作用所致,遺傳方式不遵循孟德爾遺傳模式癌癥

糖尿病

高血壓

冠心病

精神分裂癥

……2003年1953年遺傳學(xué)研究的三大里程碑

人類基因組研究第一次浪潮

2005年多國(guó)參與的合作項(xiàng)目構(gòu)建不同人群的高密度SNP圖譜確立SNP在人群中的常見分布和傳遞模式每1000個(gè)堿基對(duì)中有1個(gè)SNP,個(gè)體遺傳信息有99.9%是相同，差異0.1%。發(fā)現(xiàn)與這些差異可以了解常見疾病相關(guān)基因?yàn)榻沂救祟惖倪z傳機(jī)制，發(fā)現(xiàn)常見疾病相關(guān)基因提供方向；為發(fā)現(xiàn)復(fù)雜疾病易感基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)、研究策略和先進(jìn)技術(shù)人類基因組單體型圖計(jì)劃（HapMap計(jì)劃）

GWAS基于“常見疾病，常見突變”學(xué)說，通過整個(gè)人類基因組來尋找常見遺傳變異的可見性狀間關(guān)系的研究方法全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)?GWAS原理

ATGCAAGCTGATCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGCATGCAAGCTGTTCGATCGATCGCGACCATGCAGCACCTGACTGC病例對(duì)照原理：在一定人群中，某個(gè)等位基因或基因型在病例和對(duì)照組中存在差異，說明它與疾病有關(guān)聯(lián)性病例對(duì)照

在病例中等位基因C的頻率明顯高于對(duì)照提示：等位基因C與疾病存在一定關(guān)聯(lián)性55%35%45%65%30.25%12.25%20.25%42.25%45.5%49.5%GWAS舉例

全基因組關(guān)聯(lián)分析GenomewideassociationstudyGWAS優(yōu)勢(shì)GWAS癌癥研究(NG,2008-)已完成或正進(jìn)行：乳腺、前列腺、肺、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、睪丸生殖細(xì)胞腫瘤、胰腺、膀胱、腎臟、卵巢癌和造血系統(tǒng)腫瘤等食管癌：日本1篇小樣本文章尚無中國(guó)漢族人食管癌GWAS資料“863”計(jì)劃將對(duì)威脅我國(guó)人口健康的5類常見重大疾?。壕窦膊?、高血壓、糖尿病、食管癌和肺癌進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析研究。選擇tagSNPs標(biāo)記單體型在病例-對(duì)照人群間比較SNPs等位基因頻率全基因組關(guān)聯(lián)統(tǒng)計(jì)分析，得出有意義的SNPs另外選擇獨(dú)立的病例-對(duì)照人群對(duì)初篩階段的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證GWAS技術(shù)路線HapMap計(jì)劃初篩階段重復(fù)驗(yàn)證階段利用芯片對(duì)所有tagSNPs進(jìn)行基因分型研究對(duì)象中國(guó)漢族人群全部21496例初篩2810例（病例1077例/對(duì)照1733例）

驗(yàn)證18686例（病例7673例/對(duì)照11013例）入組標(biāo)準(zhǔn)資料詳實(shí)完整病例/對(duì)照為同一地區(qū)自愿參加病例組無治療史病例組病理證實(shí)食管癌分期按UICC2007標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照組三代親屬中無食管癌病例對(duì)照組經(jīng)內(nèi)鏡檢查除外早期食管癌不符合以上標(biāo)準(zhǔn)予以除外資料及血樣收集

45家醫(yī)院：全國(guó)范圍，華北為主問卷調(diào)查：統(tǒng)一格式采集外周靜脈血食管癌GWAS合作研究研討會(huì)2009.4.5-6安陽DNA提取及標(biāo)化

QIAGEN（德國(guó)）基因組DNA提取試劑盒按標(biāo)準(zhǔn)程序提取每份血樣的DNA準(zhǔn)確測(cè)定每份待標(biāo)化DNA的濃度初篩濃度：50ng/μl，OD值1.8-2.0

驗(yàn)證濃度：15ng-20ng/μl，OD值1.7-2.0基因分型和質(zhì)控

初篩：IlluminaHuman610-Quad芯片驗(yàn)證：SequenomiPLEX

芯片具體步驟：（6）清潔芯片（7）染色（8）芯片掃描（9）數(shù)據(jù)質(zhì)控（1）制備MSA1板（2）片段化（3）沉淀（4）重懸（5）雜交優(yōu)勢(shì)技術(shù)：綜合了BeadArray高密度微陣列技術(shù)和GoldenGate多通道位點(diǎn)特異性延伸擴(kuò)增檢測(cè)方案通量：一次分型的SNP位點(diǎn)達(dá)到55萬－60萬,同時(shí)可以定制自己感興趣的位點(diǎn)Illumina分型芯片統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)質(zhì)控：計(jì)算樣本得率、SNP得率、最小等位基因頻率、哈迪·溫伯格遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)用Plink1.03軟件分析Cochran-Armitage趨勢(shì)檢驗(yàn)：計(jì)算P值、優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）初篩

50萬個(gè)SNPS

病例1077

病例937對(duì)照1733

對(duì)照692趨勢(shì)檢驗(yàn)

進(jìn)入初篩去除不匹配者

80個(gè)SNPS

18個(gè)SNPS

2個(gè)SNPS

全基因組曼哈頓圖

（937病例/692對(duì)照）選點(diǎn)選點(diǎn)18個(gè)SNPS2個(gè)SNPS

病例7673例/對(duì)照11013例

rs2274223rs13042395驗(yàn)證研究了在目標(biāo)SNP和基因位點(diǎn)處相關(guān)區(qū)域的重組和鏈鎖不平衡類型兩個(gè)易感基因分別定位

phospholipaseCepsilon1(PLCE1),10q23

chromosome20openingreadingframe54(C20orf54),20p13基因定位兩個(gè)易感基因和腫瘤密切相關(guān)PLCE1（磷脂酶基因亞運(yùn)型）對(duì)多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有促進(jìn)作用C20orf54（核黃素轉(zhuǎn)運(yùn)基因）調(diào)節(jié)人類核黃素的轉(zhuǎn)運(yùn)，而核黃素缺乏是增加食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的重要風(fēng)險(xiǎn)因子PLCE1蛋白表達(dá)在不同病變組織差異顯著0102030405060708090正常組織食管鱗癌癌前病變%P=2.08E-13陽性陰性結(jié)果提示免疫組化發(fā)現(xiàn)隨食管癌變過程的進(jìn)展，即正?！┣安∽儭?rùn)癌各級(jí)組織中PLCE1蛋白陽性表達(dá)率逐漸升高

進(jìn)一步提示：PLCE1的遺傳變異在食管癌變過程中起重要作用，PLCE1可能是中國(guó)漢族人食管鱗狀細(xì)胞癌的致病基因食管癌變各階段免疫組化染色DYSNORCISSCC王立東，周福有，等ADH1B位于4q21-23ALDH2位于12q24兩個(gè)基因都與酒精代謝有關(guān)日本食管鱗癌GWAS結(jié)果增加食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)下一步工作計(jì)劃增加樣本量，再篩出幾個(gè)易感基因?qū)⑺l(fā)現(xiàn)的易感基因在世界各地樣品進(jìn)行驗(yàn)證，找出種族差異進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)研究，用于食管癌早篩相關(guān)功能研究，靶向藥物的研制GWAS臨床應(yīng)用GWAS重復(fù)驗(yàn)證明確基因和基因產(chǎn)物確定功能開發(fā)基因靶向治療藥物開展個(gè)體化治療開發(fā)診