65.020.30CCS

B

4415 DB15/T

3259—2023羊肝細胞體外培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程The

code

of

practice

lamb

in

vitro

2023-12-15

發(fā)布 2024-01-15

實施內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB15/T

3259—2023 本文件按照GB/T

1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提出。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會（SAM/TC

19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院。拉、劉威、寶華、胡曉曉、李文婷、付樂。DB15/T

3259—20231 范圍本文件規(guī)定了羊肝細胞體外培養(yǎng)技術(shù)規(guī)程的程序確立、工作區(qū)條件和方法。本文件適用于羊的肝細胞體外培養(yǎng)。2 規(guī)范性引用文件文件。GB/T

6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。肝細胞體外培養(yǎng) in

culture

of

以羊肝臟組織為材料，經(jīng)體外培養(yǎng)、分離出呈圓球形、分散狀態(tài)細胞的過程。4 設(shè)施設(shè)備工作區(qū)應(yīng)包括準(zhǔn)備室、緩沖間、無菌室及細胞保存室。無菌室應(yīng)配備超凈工作臺、紫外燈、酒精燈、二氧化碳培養(yǎng)箱等相關(guān)設(shè)備。細胞保存室應(yīng)配備冰箱、超低溫冰箱和液氮罐等設(shè)備。5 方法試劑與溶液配制5.1.1 如無特別說明，所用試劑均為分析純。5.1.2 本標(biāo)準(zhǔn)所用水，一律應(yīng)符合

GB/T

6682

中三級水。5.1.3 磷酸氫二鈉、氯化鈉、鹽酸、氯化鈣、氯化鉀、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、葡萄糖、

1640

RPMI16404-(2-羥乙基HEPESPBS0.4%臺盼藍溶液。5.1.4 肝素鈉：將

1

g

肝素鈉溶解于

mL

水中，用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，分裝并保存于

箱中備用。×10

mol/L

的胰島素母液，用

0.22

μm×10

mol/L

的胰島素母液，用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，分裝并保存于-80

℃冰箱中備用。5.1.13 RPIM1640

貼壁培養(yǎng)液：在每

200

mL

RPIM1640

基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入

mL

胎牛血清、10 mol/L的胰島素

0.460

mL、10 mol/L

的地塞米松

16

μL、雙抗

2

mL，5

mg/mL

的維生素

C

8

μL

0.22

μm5.1.5 Ⅳ型膠原酶：準(zhǔn)確稱取

mg

的Ⅳ型膠原酶粉末溶解于

1

的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，即可配制成

50

的Ⅳ型膠原酶，配置完成后立即使用。5.1.6 雙抗：準(zhǔn)確稱取

1

g

鏈霉素和

0.625

g

青霉素，充分溶解于

mL

的水中，用

0.22

μm

過濾除菌，分裝并保存于

℃冰箱中備用。5.1.7 胰島素母液：50

mg

胰島素溶解于

20

mL

0.01

mmol/L

4.36

mol/L-45.1.8Percoll

細胞分離液：取

mL

Percoll

液，加入

3

mL

PBS

液（×）混勻，再從混勻的液體中取

9

mL

加入

15

（1×），與離心后的肝細胞沉淀混合。5.1.9 灌流液

A：準(zhǔn)確稱取

g

氯化鈉、0.4995

g

氯化鉀、2.3831

g

HEPES、0.4500

g

葡萄糖和

0.1861

g

800

1000

mL

1

mmol/L

鹽酸或

l

mmol/L氫氧化鈉調(diào)整

pH

7.2。在無菌超凈工作臺，按

1:100

加入雙抗，用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，4

℃保存?zhèn)溆茫褂们?/p>

℃預(yù)熱。5.1.10 灌流液

B：準(zhǔn)確稱取

g

氯化鈉、0.4995

g

氯化鉀、6.8493

g

HEPES、0.4500

g

葡萄糖和

g

氯化鈣，溶于

800

mL

水中，加水定容至

1000

0.22

μm

濾膜過濾除菌，4

℃保存?zhèn)溆茫褂们?/p>

℃預(yù)熱。5.1.11 灌流液

C：在灌流液

B

的基礎(chǔ)上，每

500

B

2

的

50

g/L

的

IV

膠原酶母液，使其含有

的

IV

膠原酶。用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前

37

℃預(yù)熱。5.1.12 RPIM1640

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：將一袋

RPIM1640

粉末培養(yǎng)基于

1

L

g

碳酸氫鈉調(diào)節(jié)

0.22

m

的過濾器過濾除菌，放

冰箱冷藏備用。-6-6濾膜過濾除菌，分裝封口，4

℃保存?zhèn)溆谩?.1.14 RPIM

1640

RPIM1640

基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加

5%的胎牛血清和

0.22

μm濾膜過濾除菌，分裝封口，4

℃保存?zhèn)溆谩?.1.15 凍存液：將胎牛血清、

及

RPMI1640

培養(yǎng)液按

2:1:7

比例混合，用

0.22

μm

濾膜過濾除菌，現(xiàn)配現(xiàn)用。培養(yǎng)方法5.2.1 肝細胞分離及培養(yǎng)5.2.1.1 羊空腹

24

h

后側(cè)臥保定，腹部剪毛消毒后靜脈麻醉，靜脈注射每千克體重

1500

IU

的肝素鈉。剖開腹腔無菌取肝臟尾狀突約

g，置于無菌器皿內(nèi)迅速將其轉(zhuǎn)入細胞間。5.2.1.2 清洗肝臟尾狀突表面血跡，對切面進行修整使血管充分暴露，切面的血管數(shù)一般為

2～3

灌注時灌流液滴灑，另一端灌注灌流液。5.2.1.3 灌注灌流液

A，灌注液流速約為

50

mL/min，持續(xù)

min～15

min。5.2.1.4 灌注灌流液

B，灌注液流速約為

50

mL/min，隨著灌流液的注入，肝臟尾狀突逐漸變得充盈，尾狀突由中間至四周從暗紅色變至棕白色，流出的灌流液由血色變澄清。5.2.1.5 灌注灌流液

C，灌注液流速約為

20

mL/min，尾狀突逐漸變軟，且流出的灌流液逐漸混濁。5.2.1.6

mL～50

mL

和結(jié)締組織去除，剪去周邊未被消化部分。5.2.1.7

100

目(150

μm)、

目

μm)及500

目

(30

μ細胞篩過濾消化后的肝組織。5.2.1.9 用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液調(diào)整為

2.6

個5.2.1.9 用貼壁培養(yǎng)液將細胞懸液調(diào)整為

2.6

個×

個

2

mL，5.2.1.8 收集肝細胞懸液，用

500

r/min

冷凍離心機離心

5

～10

min，棄上清液用

RPMI1640

培養(yǎng)液清洗

2～3

次，用

RPMI1640

貼壁培養(yǎng)液重懸，0.4%臺盼藍檢測細胞活率，血細胞計數(shù)板計數(shù)。6置于二氧化碳培養(yǎng)箱

37

℃、5%

CO2條件下培養(yǎng)。5.2.1.10 4

h

后換成生長培養(yǎng)液，以后每

2

d

更換一次培養(yǎng)液，并對肝細胞形態(tài)及生長情況進行跟蹤記錄。5.2.2 肝細胞純化5.2.2.1 將肝細胞懸液用

RPMI1640

生長培養(yǎng)液清洗

2～3

次，500

5

min～min，棄上清液。5.2.2.2 用

Percoll

細胞分離液重懸肝細胞，2000

r/min

冷凍離心機離心

得到純化的肝細胞。5.2.2.3 用

RPMI1640

生長培養(yǎng)液重懸，

r/min

冷凍離心機離心

3

min

2

RPMI1640生長培養(yǎng)液重懸肝細胞制成純化的肝細胞懸液備用。5.2.3 肝細胞凍存5.2.3.1 在細胞匯合前，將細胞同培養(yǎng)液一同吸出，放入

4

mL

離心管中。5.2.3.2 在培養(yǎng)皿中加入

1

mL

4～5

次，使胰蛋白酶溶液與細胞充分接觸。5.2.3.3 1000

5

，吸出含酶的上清溶液。5.2.3.4 將細胞生長面洗脫，用

mL

培養(yǎng)液再次懸浮，

r/min

離心

5

1

凍存液重新懸浮細胞。5.2.3.5 加入適量凍存液，為凍存做準(zhǔn)備。5.2.3.6 將

1

凍存液懸浮的細胞移至

離心管中，用脫脂棉將凍存管包好后放入樣品袋中，管口朝上放入

4

℃冰箱

2

h

左右，取出放入

℃冰箱過夜，次日將其移至

℃冰箱中過夜，最后投入液氮罐中保存。5.2.4 肝細胞復(fù)蘇5.2.4.1 將凍存管于

37

5.2.4.2 用

RPMI1640

培養(yǎng)液稀釋，400

r/min

5

，棄上清液，加入培養(yǎng)液吹打均勻，用移液器將細胞移入加有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，放入

5%

2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5.2.5 肝細胞傳代5.2.5.1 當(dāng)細胞鋪滿培養(yǎng)皿底約

后，將培養(yǎng)皿移入超凈工作臺，倒掉培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液。5.2.5.2向培養(yǎng)皿中加入

0.25%胰蛋白酶，37

℃消化

1

至

80%的細胞脫壁。5.2.5.3

胎牛血清的

RPMI1640

于

37

℃、5%

2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。羊肝細胞體外培養(yǎng)程序流程圖參見附錄

A。DB15/T

3259—2023

附錄 A（資料性）羊肝細胞體外培養(yǎng)程序流程圖羊肝細胞體外培養(yǎng)程序流程圖參見圖A.1。肝細胞分離及培養(yǎng)（見

5.2.1）羊只處理（見

）肝臟取樣后預(yù)處理（見

）灌注灌流液（見

5.2.1.3、、5.2.1.5）去除結(jié)締組織（見

）收集過濾消化后的肝組織（見

5.2.1.7）離心、重懸細胞（見

5.2.1.8）接種、培養(yǎng)（見

5.2.1.9、）肝細胞純化（見

5.2.2）肝細胞凍存（見

5.2.3）肝細胞復(fù)蘇（見

5.2.4）肝細胞傳代（見

5.2.5）圖A.1

羊肝細胞體外培養(yǎng)程序流程圖DB15/T

3259—2023參