羧肽酶第7章生物催化劑—酶Enzymes本章主要內容：

酶的普通概念酶的組成與維生素酶的構造與功能的關系酶的催化機理酶反響的動力學 酶活性的調理1.酶的概述 酶是由活細胞產生的，能在體內或體外起同樣催化作用的一類具有活性中心和特殊構象的生物大分子，包括蛋白質和核酸。絕大部分酶是蛋白質，還有一些核糖核酸RNA具有催化作用，稱為核酶〔ribozyme〕。1.1定義細胞的代謝由成千上萬的化學反響組成，幾乎一切的反應都是由酶〔enzyme〕催化的。酶對于動物機體的生理活動有重要意義，不可或缺。酶在消費實際中有廣泛運用?！锔咝悦傅拇呋饔每墒狗错懰俣缺确谴呋错懱岣?08-1020倍。比其他催化反響高106-1013倍★專注性即對底物的選擇性或特異性。一種酶只催化一種或一類底物轉變成相應的產物。1.酶的概述1.2酶的催化特性①絕對專注性②相對專注性③立體專注性

絕對專注性一種酶只催化一種底物轉變為相應的產物。例如，脲酶只催化尿素水解成CO2和NH3。 相對專注性 一種酶作用于一類化合物或一類化學鍵。不同的 例如，不同的蛋白水解酶對于所水解的肽鍵兩側的基團有要求。

立體專注性 指酶對其所催化底物的立體構型有特定的要求。 例如，乳酸脫氫酶專注地催化L-乳酸轉變為丙酮酸，延胡索酸只作用于反式的延胡索酸〔反丁烯二酸〕。立體專注性保證了反響的定向進展。R1:Lys,ArgR2:不是ProR3:Tyr,Trp,PheR4:不是Pro★酶容易變性這是酶的化學本質〔蛋白質〕所決議的?！锩傅目烧{理性抑制和激活〔activationandinhibition〕反響控制(feedback)酶原激活(activationofproenzyme)變構酶(allostericenzyme)化學修飾(chemicalmodification)多酶復合體(multienzymecomplex)酶在細胞中的區室化(enzymecompartmentalization)1.酶的概述知的上千種酶絕大部分是蛋白質。單純酶：僅由蛋白質組成的酶。少數，例如：溶菌酶結合酶：除蛋白質外，還有非蛋白質成分。大多數。全酶=酶蛋白+輔助因子輔助因子包括:十幾種輔酶、輔基，還有一些金屬離子。2.酶的組成與維生素2.1酶的化學本質酶蛋白的作用：與特定的底物結合，決議反響的專注性。輔酶、輔基的作用：參與電子的傳送、基團的轉移等，決議了酶所催化反響的性質。 輔酶與輔基都是耐熱的有機小分子，構造上常與維生素和核苷酸有關。輔酶與酶蛋白結合不緊，容易經透析除去，而輔基與酶蛋白共價相連。金屬離子的作用：它們是酶和底物聯絡的“橋梁〞；穩定酶蛋白的構象；酶的“活性中心〞的部分。2.酶的組成與維生素2.1酶的化學本質〔Vitamin〕是動物和人類生理活動所必需的，從食物中獲得的一類有機小分子。它們并不是機體的能量來源，也不是構呵斥分，大多數以輔酶、輔基的方式參與調理代謝活動。A視黃醇〔維生素A脂溶性維生素：原——胡蘿卜素〕DEK 鈣化醇生育酚凝血維生素 2.酶的組成與維生素2.2維生素與輔酶和輔基的關系 維生素B族維生素輔酶形式酶促反應中的主要作用硫胺素素(B(B1)硫胺素焦磷酸酯酯(TPP)(TPP)α-酮酸氧化脫羧酮基轉移作用核黃素素(B(B2)黃素單核苷酸酸(FMN)(FMN)黃素腺嘌呤二核苷酸酸(FAD)(FAD)氫原子轉移氫原子轉移尼克酰胺胺(PP)(PP)

+尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸酸(NAD(NAD)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸

+(NADP)氫原子轉移氫原子轉移吡哆醇醇((醛、胺胺))(B6)磷酸吡哆醛氨基轉移泛酸輔酶酶A(CoAA(CoA)A(CoA)酰基轉移葉酸四氫葉酸"一碳基團團""轉移生物素素(H)(H)生物素羧化作用鈷胺素素(B(B12)甲基鈷胺素5′-脫氧腺苷鈷胺素甲基轉移B族維生素及其輔酶方式含2-60個亞基，有復雜的高級構造。常經過變構效應在 代謝途徑中發揚重要的調理作用。多酶復合體 由多個功能上相關的酶彼此嵌合而構成的復合體。它可以促 進某個階段的代謝反響高效、定向和有序地進展。串聯酶或多功能酶 催化相關代謝反響的酶蛋白基因 在進化過程中交融，使遺傳信息表達后生成一條多肽鏈，卻具有多 種不同催化功能。3.酶的分子構造 根據酶蛋白分子構造的特點，可將其分為： 單體酶 只需三級構造，一條多肽鏈的酶。如129個氨基酸的溶菌酶， 分子量14600。 寡聚酶ACP蛋白組成。 大腸桿菌的丙酮酸脫氫酶系模型3.酶的分子構造 功能上相關的幾個酶 在空間上組織在一同， 定向有序地催化一系 列反響。 例如，丙酮酸脫氫酶系 由3個酶組成，脂肪酸 合成酶系由6個酶和1個指酶分子中直接和底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位?！?〕酶活性中心的組成：必需基團：對酶發揚活性所必需的基團。對于結合酶，輔助因子經常是活性中心的組成部分。這些基團在一級構造上能夠相距很遠，甚至能夠不在一條肽鏈上，但在蛋白質空間構造上彼此接近，構成具有一定空間構造的區域。3.酶的分子構造 3.1酶的活性中心〔2〕酶活性中心的特點不是剛性的，而具有一定的柔性?！布s1%2%〕，相當于23個氨基酸殘基?！艋钚灾行脑诿阜肿涌傮w積中只占相當小的部分◆都是酶分子外表的一個凹穴，有一定的大小和外形，但◆活性中心為非極性的微環境，有利于與底物結合。的活性中心。◆底物與酶經過構成較弱鍵力的次級鍵相互作用并結合到酶◆酶與底物結合的過程中，底物分子或酶分子或它們兩者的構 象同時發生一定變化后才相互契合，這時催化基團的位置也 正益處于所催化底物的敏感化學鍵部位。結合基團：底物在此與酶分子結合。一個酶的結合部位又可以分為各種亞位點，分別與底物的不同部位結合。催化基團：底物的敏感鍵在此被打斷或構成新的鍵，從而發生一定的化學反響。一個酶的催化部位可以不止一個。必需基團按其作用可分為：Substratestypicallylosewaters(ofhydration水協作用)intheformationoftheEScomplex酶的活性中心表示圖活性中心是酶分子上由催化基團和結合基團構成的一個微區。多肽鏈 底物分子酶活性中心催化基團 結合基團活性中心必需基團活性中心以外必需基團e〕，在特定的條件下，經過部分肽段的有限水解，轉變成有活性的酶。如，動物的消化酶。 3.酶的分子構造3.2酶原激活 無活性的酶原 〔 pro en zy m指催化一樣的化學反響，但是理化性質不同的一組酶。如，氨基酸組成、電泳行為、免疫原性、米氏常數等不同。3.3同工酶〔isozyme〕3.酶的分子構造以乳酸脫氫酶〔LDH〕為例LDH是1959年發現的第一個同工酶。由4個亞基組成的寡聚酶，亞基分為M型和H型。因此可以裝配成五種四聚體：H4(LDH1)、H3M(LDH2)、H2M2(LDH3)、HM3(LDH4)、M4(LDH5)不同的LDH分布在不同組織中。例如，脊椎動物心臟中主要是LDH1，而骨骼肌的那么是LDH5。LDH1(H4)LDH2(H3M)LDH3(H2M2)LDH4(HM3)LDH5(M4)不同組織中的LDH同工酶的電泳圖譜化學反響是由具有一定能量的活化分子相互碰撞發生的。分子從初態轉變為激活態所需的能量稱為活化能。無論何種催化劑，其作用都在于降低化學反響的活化能，加快化學反響的速度。4.酶的催化機理4.1活化能非催化反響和酶催化反響活化能的比較Ea，活化能；ΔG，自在能變化S+EESP+E 中間產物后人進一步開展了中間產物學說：S+EESES*EPP+E過渡態復合物4.酶的催化機理 4.2催化機理目前較稱心的解釋是—中間產物學說 酶介入了反響過程。經過構成不穩定的過渡態中間復合物，使本來一步進展的反響分為兩步進展，而兩步反響都只需較少的能量活化。從而使整個反響的活化能降低。酸堿催化：活性中心的一些基團，如His，Asp作為質子的 受體或供體，參與傳送質子。共價催化：酶與底物構成過渡性的共價中間體，限制底物的活動，使反 應易于進展。疏水效應：活性中心的疏水區域對水分子的排除、排斥，有利于酶與底 物的接觸。4.酶的催化機理 在一個化學反響中，過渡態的構成和活化能的降低是反響 進展的關鍵步驟，任何有助于過渡態構成與穩定的要素都有利 于酶行使其高效性。如今以為，與酶作用高效性有關的重要因 素有以下五個方面。 臨近與定向效應：添加了酶與底物的接觸時機和有效碰撞。 張力效應：誘導底物變形，扭曲，促進了化學鍵的斷裂。4.3鎖鑰學說(LockandkeyHypothesis) 酶和底物的結合狀如鑰匙與鎖的關系。底物分子或其一部分象鑰匙一樣，專注地楔入到酶的活性中心部位，即底物分子進展化學反響的部位與酶分子活性中心具有嚴密互補的關系。4.酶的催化機理4.酶的催化機理4.3誘導契合學說〔inducedfit〕1958年D.E.Koshland提出酶分子活性中心的構造原來并非和底物的構造相互吻合，但酶的活性中心是柔性的而非剛性的。 當底物與酶相遇時，可誘導酶活性中心的構象發生相應的變化，其上有關的各個基團達到正確的陳列和定向，因此使底物和酶能完全契合。當反響終了產物從酶分子上零落下來后，酶的活性中心又恢復成原來的構象。

酶促反響動力學：研討酶促反響速度及其影響要素。

反響速度：單位時間內底物減少或產物添加的速度，常用初速度來衡量。5.酶促反響的動力學 概念：影響酶促反響速度的要素：反響溫度pH值酶濃度[E]底物濃度[S]抑制劑I激活劑A最適溫度〔optimumT〕：使酶促反響速度達到最大時的溫度。最適溫度因不同的酶而異，動物體內的酶的最適溫度在37~400C左右。酶的最適溫度并非酶的特征性常數，它與底物、作用時間等要素有關。5.1溫度對酶促反響速度的影響5.酶促反響的動力學酶反響的溫度曲線和最適溫度5.2溶液pH值對酶促反響速度的影響5.酶促反響的動力學最適pH〔optimumpH〕：使酶促反響速度達到最大時溶液的pH。pH影響酶分子解離形狀。pH影響底物的解離，從而影響酶與底物的結合。極度pH的條件引起酶蛋白的變性。酶的最適pH普通在7左右。也有很多例外，如胃蛋白酶的最適pH只需1.5，胰蛋白酶(7.8)。酶的最適pH并非酶的特征性常數，它與底物的種類、濃度等要素有關。在其他條件確定時，當底物濃度大大超越酶濃度時，反響速度與酶的濃度成正比。5.3酶濃度對酶促反響速度的影響5.酶促反響的動力學0.2Vm 20.1例--變--[S]與v關系：當[S]很低時，，[S]與v成比例--一級反響當[S]較高時，，[S]與v不成比例當[S]很高時，，[S]，v不變--零級反響012345678[S]5.酶促反響的動力學5.4底物濃度對酶促反響速度的影響 v Vm 0.3米-曼氏方程式〔Michaelis-Mentenequation〕V=Vmax[S]Km+[S]米-曼氏方程解釋：當[S]Km時，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]當[S]Km時，vVmax,即[S]而v不變V=Vmax[S]Km+[S] Km的意義米氏常數Km=(k2+k3)/k1

Km等于酶促反響速度為最大速度一半時的底物濃度。所以Km的單位為濃度單位。

Km是酶的特征性常數，可表示酶與底物的親和力。在反響的起始階段，k３<<k２，Ｋm≈k２／k1≈１／Ｋ平≈Ｋ解離Ｋm越大，闡明Ｅ和Ｓ之間的親和力越小，ＥＳ復合物越不穩定。Ｋm越小，闡明Ｅ和Ｓ的親和力越大，ＥＳ復合物越穩定，也越有利于反響。E+SESE+PK3K4K1K2Vmax 2

Vmax[S] Km[S]Km=[S]所以采用雙倒數作圖法：即1/v-1/[S]作圖 1Vmax 1[S]

KmVmax1v Km值與Vmax值的測定v-[S]作圖法： Vmax難以測定，不能從vV/2處求得，從而導致Km也難確定。 1Vmax 1[S]

KmVmax1v5.5抑制劑對酶促反響速度的影響5.酶促反響的動力學酶的抑制劑〔inhibitor〕:凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質。抑制造用可分為：可逆抑制造用和不可逆抑制造用兩大類。〔一〕可逆抑制造用〔reversibleinhibition〕 抑制劑與酶蛋白以非共價方式結合，引起酶活性暫時性喪失。抑制劑可以經過透析、超濾等物理方法被除去，并且能部分或全部恢復酶的活性。根椐抑制劑與酶結合的情況，又可以分為競爭性抑制、非競爭性抑制等。1、競爭性抑制造用〔competitiveinhibitor〕 某些抑制劑的化學構造與底物類似，與底物競爭酶的活性中心并與之結合，從而減少了酶與底物的結合，因此降低酶反響速度。這種作用稱為競爭性抑制造用。競爭性抑制的動力學特點是Vmax不變，而Km增大競爭性抑制的特點：I與S分子構造類似；Vmax不變，Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對濃度比例；增大[S]可減輕或消除抑制造用.例1：丙二酸是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。 這種抑制造用可經過添加底物濃度而使整個反響平衡向生成產物的方向挪動，因此能減弱或解除這種抑制造用。琥珀酸延胡索酸丙二酸例2：磺胺類藥物的抑菌作用H2NH2N COOH對氨基苯甲酸 SO2NHR磺胺類藥物對氨基苯甲酸 二氫喋呤啶 谷氨酸二氫葉酸合成酶二氫葉酸復原酶二氫葉酸四氫葉酸2.非競爭性抑制〔non-competitiveinhibition〕 某些抑制劑結合在酶活性中心以外的部位，因此與底物 和酶的結合無競爭，即底物與酶結合后還能與抑制劑結合， 同樣抑制劑與酶結合后還能與底物結合。但酶分子上有了抑 制劑后其催化功能基團的性質發生改動，從而降低了酶活性。 這種作用稱為非競爭性抑制造用。E+SESE+P+ I EI+S + IIES在可逆的非競爭性抑制造用中：抑制劑結合在活性中心以外；抑制劑的結合阻斷了反響的發生。非競爭性抑制造用的動力學特點是Vmax變小，而Km不變。 非競爭性抑制的特點：1、I與S分子構造不同；2、Vmax減小，Km不變；3、抑制程度取決于[I]大小。4、這種抑制造用不能用添加底物濃度的方法來消除SHSE+Hg2+EHg+2H+SHSHClS SE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HClSSHCl巰基酶路易士氣(二)不可逆抑制〔irreversibleinhibition〕 抑制劑與酶的必需基團以結實的共價鍵結合,不能用透析超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復活性。 例1：巰基酶的抑制EHg+SSCOONaCHSHCHSHCOONa SH CHSE+Hg CHS SHCOONa COONa二巰基丁二酸鈉SCH2OHSHCH2OHE+CHSAs-CH=CHCl SHCH2SEAs-CH=CHCl+CHSH SCH2SH 二巰基丙醇解毒方法：可使-OH磷酯化，所以它是活性中心有Ser殘基的酶的抑制劑。 常見的有機磷農藥，如敵敵畏、敵百蟲，它們殺滅昆蟲的機理就在于可抑制乙酰膽堿酯酶的活性，該酶的作用是將神經遞質乙酰膽堿水解，假設它被抑制，會導致乙酰膽堿的積累，使神經過度興奮，引起昆蟲的神經系統功能失調而中毒致死。例2：羥基酶的抑制

金屬離子：Mg2+、K+、Mn2+

陰離子： 有機物： Cl-膽汁酸鹽2、分類：

必需激活劑非必需激活劑Mg2+對己糖激酶 Cl-對淀粉酶5.酶促反響的動力學 5.6激活劑對酶促反響速度的影響 1、激活劑:凡能使酶由無活性變為有活性或使酶 活性添加的物質。如：6.酶活性的調理 主要調理方式:酶活性的調理變構調理 共價修飾調理酶含量的調理6.1變構調理概念：

變構調理：生物體內一些代謝物可與酶分子的調 節部位進展非共價可逆性結合，改動酶分子構 象，從而改動酶的活性。變構酶：受變構調理的酶。變構劑：導致變構效應的代謝物。催化部位：調理部位：Thethree-dimensionalsubunitarchitectureoftheregulatoryenzymeaspartatetranscarbamoylase;twodifferentviews.Thisallostericregulatoryenzymehastwocatalyticclusters,eachwiththreecatalyticpolypeptidechains,andthreeregulatoryclusters,eachwithtworegulatorypolypeptidechains.Thecatalyticpolypeptidesineachclusterareshowninshadesofblueandpurple.Bindingsitesforallostericmodulatorsarefoundontheregulatorysubunits(showninwhiteandred).Modulatorbindingproduceslargechangesinenzymeconformationandactivity.變構酶模型米氏雙曲線與S形變構曲線6.酶活性的調理 0.11ATP、檸檬酸〔—〕AMP、ADP2,6-二磷酸果糖1,6-二磷酸果糖(+)6-磷酸果糖激酶-1的變構調理生理意義：①變構酶有特征性的S形動力學曲線。變構劑或底物濃度，在一定的范圍里，一個比較小的變化就會導致反響速度顯著的改動，因此更具可調理性。②變構酶通常是關鍵酶，催化代謝途徑中的非平衡反應，或稱不可逆反響。這些酶普通處在途徑的開場階段或分支點上，經過反響控制來調理。 6.酶活性的調理6.2共價修飾調理酶的共價修飾調理：概念：酶蛋白分子上的某些氨基酸殘基的 基團，在另一組酶的催化下發生可逆的 共價修飾，從而改動酶的活性。常見修飾方式：磷酸化和去磷酸化EATPADPPH2O蛋白激酶磷蛋白磷酸酶肌肉中磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化過程： E磷酸化酶-b P磷酸化酶-a無活性有活性7.酶的命名與分類7.1酶的命名(1)習慣命名：由發現者命名，常以底物名、反應性質以及酶的來源命名；(2)系統命名〔1961年國際酶學委員會確定〕每一個酶由以下三種表示：1、系統稱號：底物名+反響性質2、分類編號：E.C.+四個數字3、引薦名：選一個習慣名〔適用、簡單〕1961年酶學委員會〔EnzymeCommission，EC〕規定酶的表示法：EC.X.X.X.X例如：乳酸脫氫酶7.2酶的分類

氧化復原酶AH2+BA+BH2轉移酶水解酶裂解酶異構酶合成酶 Ax+C AB+H2O A AA+B A+Cx AH+BOHB+C B C，需求ATPPOHOOHN32NHVB1，硫胺素經焦磷酸化轉變為TPP，焦磷酸硫胺素。它是酮酸脫氫酶的輔酶。 以VB2，核黃素為根底構成兩種輔基 FMN黃素單核苷酸和FAD黃素腺嘌呤 二核苷酸。作用是傳送氫和電子。SCH3NCH3NO OH HOO P硫胺素焦磷酸硫胺素TPP N+HH2N87965N14ON10OHOHNOHN5OHNONNNNNH2OOHOHPOOO-OPOOO-FMNFADH 10 R2e-+2H+ ON2e-+2H+NNNNH2NOOHOHOOPOPOOHO OOHOHNNH2O HOHOPO O NAD+ NADP+ 尼克酸，煙酸〔維生素Vpp〕NAD+/NADH，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸〔氧化/復原〕NADP+/NADPH，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸〔氧化/復原〕。煙酰胺衍生物，傳送氫和電子，氧化復原酶的輔酶。NNH2ORHH2e-+H+2e-+H+OOH泛酸〔維生素B3〕是CoA〔輔酶A〕的組成成分。CoA是脂?；妮d體。吡哆醛和吡哆胺〔吡哆素〕，維生素B6。磷酸吡哆醛是氨基酸轉氨酶、脫羧酶等的輔酶。NOHOHH2N OOPO OH 磷酸吡哆醛 OOPON OH 磷酸吡哆胺ONNNOO OHOPOHOHNHNOSHOH NOH HOPO