第四章高效液相色譜分析概述高效液相色譜法的類型及分離原理HPLC固定相HPLC流動相HPLC儀器HPLC檢測器HPLC分離類型的選擇HPLC使用、保養(yǎng)及應用舉例液相制備色譜毛細管電泳

教學目標及要求

1、掌握高效液相色譜法的特點及適用范圍，與GC及經(jīng)典LC的異同。2、掌握高效液相色譜儀的主要部件及基本流程。3、理解常用檢測器的原理、適用的分析對象及適用范圍。4、理解各種分離方式的原理及選擇原則。5、了解制備色譜高效毛細管電泳基本原理、儀器及特點。第一節(jié)概述

高效液相色譜（HPLC）是一種以液體為流動相的快速分離分析色譜技術，采用細微粒固定相、高壓輸液泵和高靈敏度檢測器，具有高壓、高速、高效、高靈敏度的特點，對于那些沸點高，熱穩(wěn)定性差，相對分子質量大的有機化合物如烷烴、烯烴、芳烴、染料、甾族化合物、蛋白質、氨基酸、核酸等均可進行分離分析。

按照固定相不同分為：液液分配色譜；吸附色譜（液固色譜）；離子交換色譜；尺寸排阻色譜（凝膠滲透色譜）；離子色譜、平板色譜（薄層色譜）等。1.高效液相色譜特點高壓：HPLC供液壓力和進樣壓力都很高（150～350×105Pa）。高壓是的一個突出特點。高速：HPLC采用高壓輸液設備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時。高效：填充物顆粒極細且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質阻力小，因而柱效很高。可以在數(shù)分鐘內完成數(shù)百種物質的分離。高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV——10-9g,熒光檢測器——10-11g。2.HPLC與GC的比較分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定有機化合物（占總數(shù)的20%）；HPLC可分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定有機化合物（占80%）。流動相的選擇：GC采用的流動相為幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用小；HPLC采用的流動相為液體或各種液體的混合（供選擇的機會多）。它除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻很大，可通過溶劑來控制和改進分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進行。從速率理論各項的差別看HPLC與GC的區(qū)別1）渦流擴散項AA=2dp2）分子擴散項B/uB=2Dl3）傳質阻力項包括固定相傳質阻力系數(shù)和流動相傳質阻力系數(shù)改進固定相成為提高液相色譜柱效的一個重要問題結論：要提高液相色譜分離效率：提高填料均勻性，減小粒度，促進傳質實心核+多孔硅膠：大孔徑+淺孔道選用低黏度的流動相，有利于提高傳質速率流速降低→傳質阻力降低、縱向擴散增強、分析時間增加通過H－u曲線：HPLC比GC板高極小值小一個數(shù)量級，對應的最佳流速也小一個數(shù)量級。其它影響因素柱前：進樣位置，方式柱后：連接管、檢測器、死體積、死角等一、分配色譜（液－液分配色譜）原理

根據(jù)各待測物在互不相溶的兩溶液中的溶解度不同，因而具不同的分配系數(shù)。在色譜柱中，隨著流動相的移動，這種分配平衡需進行多次，造成各待測物的遷移速率不同，從而實現(xiàn)分離的過程。第二節(jié)高效液相色譜法的類型及分離原理2.流動相根據(jù)流動相與固定相極性的差別程度，可將液液色譜分為正相液-液色譜和反相液-液色譜。正相液-液色譜：流動相極性小于固定相極性，極性小的先流出，適于極性組分分離。反相液-液色譜：流動相極性大于固定相極性，極性大的先流出，適于非極性組分分離。3.固定相原則上，用于GC的固定相也可用于HPLC作固定相。但HPLC固定液易流失，因此常用的只有幾種，按極性由高到低為：

,’-氧二丙腈（ODPN)、聚乙二醇（PEM）、角鯊烷（SQ）。早期通過在擔體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學鍵合固定相（通過化學反應將有機分子鍵合在載體表面所形成的柱填充劑，具有穩(wěn)定、流失小、適于梯度淋洗等特點

）。正相色譜低極性流動相反相色譜高極性流動相中等極性流動相中等極性流動相時間時間時間時間待測物極性：A>B>C正、反相色譜中極性和保留時間的關系二、吸附色譜（液－固吸附色譜）是基于各組分在固體吸附劑表面上具有不同吸附能力而進行分離。以固體吸附劑為固定相，如極性的硅膠、氧化鋁、分子篩和非極性的活性炭等（較常使用硅膠）。流動相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。宜于分離極性不同或含極性基團相同但數(shù)目不同的試樣，也適于分離異構體，但不宜于分離同系物。

三、離子對色譜法（IPC）主要用來分離強極性有機酸和有機堿。原理：將與待測物離子A電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到流動相中，使待測離子與對離子形成離子對AB，該AB離子對的性質與A離子或B離子的性質不同，即間接改變了待測離子的保留特性。還可借助離子對的生成給試樣引入紫外吸收活發(fā)熒光的基團，以提高檢測的靈敏度。四、離子交換色譜此法是利用離子交換原理和液相色譜技術相結合，測定各類陰、陽離子的分離分析方法。它既適于無機離子，也適于有機物分離，如蛋白質、氨基酸、核酸等。1.

原理：利用不同待測離子對固定相的親和能力（或離子交換能力）的差別來實現(xiàn)分離的。五、離子色譜（IC）

以無機、特別是無機陰離子混合物為主要分析對象。原理:采用交換容量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；在分離柱后，用另外一支抑制柱來消除淋洗液的高本底電流;采用電導檢測器檢測流出組分。快速分離分析微量無機離子混合物;各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。例如：分析陽離子時，以無機酸為流動相，抑制柱為高容量的強堿性陰離子交換樹脂，則發(fā)生下列反應：R+—OH+HCl(流動相)——R+—Cl-+H2OR+—OH+MCl(待測物)——R+—Cl+M+OH-

可見，不僅大量酸轉化為低電導的水，而且待測離子轉化為具有更大淌度的堿。特點：分析速度快：可在數(shù)分鐘內完成一個試樣的分析；分離能力高：在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；

分離混合陰離子（NO3—、NO2－、SO42－、PO43－等）惟一快速、靈敏、準確的最有效分析方法。缺點：抑制柱要定期再生、譜峰在經(jīng)過抑制柱后會展寬，降低分離度。六、空間排阻色譜法又稱凝膠（滲透）色譜，主要用于大分子的分子分離。它是基于待測物分子的尺寸和形狀不同來實現(xiàn)分離的。1、分離原理：固定相為化學惰性的多孔凝膠，它類似于分子篩，但孔徑更大。凝膠內有一定大小的空穴，分子體積大的待測物不能滲入孔穴中而被排阻，較早地被淋洗出來，中等的部分滲透，小分子則完全滲透，最后流出色譜柱。即待測物分子按分子大小（分子量大小）先后從柱中流出。極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量第三節(jié)HPLC固定相一、液-液色譜法、鍵合相色譜法及離子對色譜法固定相全多孔型擔體表層多孔型擔體化學鍵合固定相：用化學反應方法通過化學鍵把有機分子結合到擔體表面化學鍵合固定相特點：無液坑、無流失、選擇性可靈活改變、有利于梯度洗提、有利于配用靈敏的檢測器和餾分收集器二、液-固吸附色譜法固定相多孔型、薄殼型三、離子交換色譜法固定相薄膜型離子交換樹脂離子交換鍵合固定相：鍵合薄殼型、鍵合微粒擔體型陽離子交換樹脂：強酸性、弱酸性樹脂陰離子交換樹脂：強堿性、弱堿性樹脂微孔型大孔型微孔微孔薄膜型表面多孔型離子交換層惰性核惰性核離子交換劑硅膠層涂覆按固定相制作方法可分為：四、排阻色譜法固定相軟質凝膠：水為流動相，孔徑大小由交聯(lián)劑控制半硬質凝膠：適用于非極性有機溶劑，不能隨意更換溶劑，能耐較高壓力，流速不宜大硬質凝膠：多孔硅膠、多孔玻珠；多孔硅膠化學穩(wěn)定性好，熱穩(wěn)定性好，機械強度高，吸附問題需要進行特殊處理。選擇填料時首先要考慮相對分子質量排阻極限第四節(jié)HPLC流動相流動相選擇注意事項純度避免對固定相的影響對試樣要有適宜的溶解度黏度小與檢測器匹配2.流動相選擇依據(jù)常用溶劑極性順序：水，甲酰胺，乙腈，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氧六環(huán)，四氫呋喃，甲乙酮，正丁醇，醋酸乙酯，乙醚，異丙醚，二氯甲烷，氯仿，溴乙烷，苯，氯丙烷，甲苯，四氯化碳，環(huán)己烷，己烷，庚烷，煤油3.離子交換色譜在含水介質中進行用流動相中鹽的濃度和pH來控制組分的保留值，增加鹽的濃度可以降低保留值。陽離子交換柱流動相pH增加，保留值降低。4.排阻色譜法流動相排阻色譜法所用溶劑必須與凝膠本身非常相似。軟質凝膠時，溶劑必須能溶脹凝膠。溶劑的黏度高將限制擴散作用而損害分辨率。第五節(jié)HPLC儀器數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)HPLC的組成-由幾個獨立的系統(tǒng)組成數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)HPLC儀器包括：高壓輸液裝置→進樣系統(tǒng)→分離系統(tǒng)→檢測系統(tǒng)此外還配有梯度淋洗、自動進樣和數(shù)據(jù)處理裝置。梯度淋洗1.高壓輸液系統(tǒng)1）貯液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶劑過濾器(Ni合金)，其孔徑約2m，可防止顆粒物進入泵內。2）脫氣：超聲波脫氣或真空加熱脫氣。溶劑通過脫氣器中的脫氣膜，相對分子量小的氣體透過膜從溶劑中除去。3）高壓泵：要求：密封性好、輸液流量穩(wěn)定無脈動、可調范圍寬、耐腐蝕。輸液泵種類：恒壓型和恒流型。4）梯度淋洗裝置：作用是在分離過程中，按一定的程序連續(xù)改變流動相中多種不同性質溶劑的配比，以改變流動相的極性、離子強度或酸度等，從而提高試樣的分離效率，縮短分析時間，使色譜峰形得到改善，提高測定的靈敏度和定量的準確度。混合器低壓梯度比例閥

高壓梯度低壓梯度脫氣機高壓/低壓梯度系統(tǒng)二元泵工作原理Damper阻尼器PurgevalveMixerABInletvalveOutletvalveWasteInletvalveOutletvalve2.進樣系統(tǒng)1）注射進樣：使用微量注射器進樣。裝置簡單、死體積小。但進樣量小且重現(xiàn)性差。2）高壓進樣閥：目前最常用的為六通閥。由于進樣量可由樣品管控制，因此進樣準確，重復性好。裝入樣品出口進樣采樣環(huán)泵入溶劑進色譜柱自動進樣器特點靈活的進樣方式：全定量部分定量攜帶進樣全定量（更準確）

部分定量（靈活，不需更換定量環(huán)）

攜帶進樣（節(jié)省樣品使用量）

3.分離系統(tǒng)1）要求：內壁光滑的優(yōu)質不銹鋼柱，柱接頭的死體積盡可能小。柱長多為15~30cm，內徑為4~5mm；2）柱的填充：主要采用勻漿法。填充方法：填充時，將制作好的勻漿液，用流動相充滿色譜柱及其延長管中，然后將勻漿液倒入勻漿填充器，在較高壓力下迅速將其注入色譜柱內。要求填充速度快（防凝聚、沉降或結塊）、且無空氣進入（影響填充均勻性）。4.檢測系統(tǒng)

靈敏度高，重現(xiàn)性好，響應快，線性范圍寬，適用范圍廣。對流動相流量和溫度波動不敏感，死體積小。紫外光度檢測器光電二極管陣列檢測器熒光檢測器示差折光檢測器電導檢測器蒸發(fā)光散射檢測器5.記錄分析系統(tǒng)第六節(jié)HPLC檢測器紫外光度檢測器熒光檢測器示差折光檢測器電導檢測器蒸發(fā)光散射檢測器幾種常用檢測器主要性能比較1.紫外檢測器

依據(jù)被分析組分對特定紫外光的選擇性吸收。最小檢測量10-9g·mL-1，對流量和溫度的波動不敏感，可用于梯度洗脫。對溫度和流速不敏感，可用于梯度洗脫，結構簡單不適用于對紫外光完全不吸收的試樣，溶劑的選用受限制為擴大應用范圍和提高選擇性可應用可變波長檢測器可通過短時間中斷液流進行快速掃描得到紫外吸收光譜紫外普通檢測器和光電二極管陣列檢測器的比較普通檢測器光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器波長可的松氟美松皮質酮快速掃描—光電二極管陣列（PDA）檢測所獲得的三維色譜-光譜圖波長范圍190～1015nm同時檢測掃描快，無需停流保留值與光譜圖結合定性可根據(jù)每個色譜峰的指定位置實時光譜比較，判斷當時所出樣品的純度及分離狀況。2.熒光檢測器

根據(jù)某些物質受激后能產(chǎn)生一定強度熒光的性質，可制成靈敏度極高的熒光檢測器。它是一種選擇性很強的檢測器，其靈敏度比UV檢測器高2~3個數(shù)量級。但線性范圍僅約10-3.適合于稠環(huán)芳烴、甾族化合物、酶、氨基酸、維生素、色素、蛋白質等熒光物質的測定。

利用可調諧的激光做光源（激光熒光光譜）可使檢測靈敏度和準確度都得到提高。原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同。為通用型檢測器，靈敏度為10-7g/mL。但對溫度變化敏感，且不適于梯度淋洗。光源調零光學零參比樣品平面鏡透鏡光電轉換記錄儀放大器遮光板3.示差折光檢測器4.電導檢測器主要用于離子色譜的檢測。

原理：基于待測物在一些介質中電離后所產(chǎn)生的電導（電阻的倒數(shù)）變化來測量電離物質的含量。受溫度影響較大，要求嚴格控制溫度，要監(jiān)測。5.蒸發(fā)光散射檢測器

是一種通用型檢測器，比示差折光檢測器靈敏度高，不受溶劑和溫度影響，可用于梯度洗脫。

不宜采用非揮發(fā)性緩沖溶液作流動相。

響應值與試樣質量成正比。可以在沒有標準品的情況下采用內標法測定未知物的近似含量。6.幾種常用檢測器的主要性能UV熒光示差折光電化學質譜蒸發(fā)光信號流速影響溫度影響檢測限(g/ml)池體積(μl)梯度洗脫樣品破壞吸光度無小10-102~10適宜無熒光強度無小10-132~7適宜無折光率無大10-7––不宜無電流有大10-13＜1不宜無離子流強度無––適宜有散射光強度無小10-9––適宜無第七節(jié)色譜分離方法的選擇

一般可根據(jù)試樣相對分子質量范圍、溶解度及分子結構等進行分離方法的初步選擇。一、根據(jù)相對分子質量選擇二、根據(jù)溶解性選擇三、根據(jù)分子結構選擇試樣溶于水不溶于水不溶于水溶于水，不解離溶于水，可解離溶于水，離子與非離子排阻色譜，水為流動相排阻色譜，非水流動相異構體多官能團同系物分子大小差異反相色譜排阻色譜（小孔），水為流動相堿酸反相離子對色譜相對分子質量>2000相對分子質量<2000正相或反相色譜吸附色譜排阻色譜陽離子交換色譜陰離子交換色譜極性增加不溶于水溶于水非極性離子非離子極性吸附反向分配分配正向分配離子交換尺寸排阻凝膠滲透凝膠過濾分子量HPLC的日常操作條件最好是恒溫、恒濕

溫度：15—30℃

相對濕度<80%房間應有良好的通風空調或其他設備產(chǎn)生的氣流不要直吹儀器避免光線直射遠離高電干擾、高振動設備第八節(jié)HPLC使用、保養(yǎng)及應用舉例1.流動相是否過濾2.水與有機溶劑混合時溫度變化大，必須待恢復到室溫時方可使用，否則易產(chǎn)生氣泡。3.更換流動相時注意兩種流動相必須具有互溶性。啟動前檢查4.更換不互溶性流動相時應先用異丙醇進行置換。5.更換緩沖鹽流動相時，用純水清洗。6.保持貯液瓶清潔，對專用貯液瓶應定期清洗；用試劑瓶作貯液瓶時，要經(jīng)常更換。7.定期在稀硝酸溶液中超聲、清洗過濾器，保持過濾器暢通無阻。8.每天開始使用儀器時注意放空排氣，確保泵頭、流動池以及其它流路系統(tǒng)中無氣泡存在。泵的使用與維護注意事項1.防止任何固體微粒進入泵體（0.2um或0.45um的微孔濾膜過濾）。2.流動相應先脫氣，以免在泵內產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性。3.泵工作時防止溶劑瓶內的流動相用完，否則空泵運轉會磨損柱塞、密封圈，導致漏液。4.輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密封環(huán)變形造成漏液。輸液系統(tǒng)5.流動相不應含有任何腐蝕性物質。6.緩沖液使用前必須過濾。7.磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液易受到細菌和霉菌的影響，不得放置過夜，應臨用現(xiàn)制。

8.含有緩沖液的流動相不應保留在泵內。使用緩沖液后用兩通管連接管路及檢測池，先用純水沖洗，然后用甲醇沖洗。管路及檢測池沖洗干凈后再沖洗色譜柱。反相柱先用含5%~7%甲醇的水沖洗色譜柱（此時不要再連接檢測池），然后用甲醇或甲醇-水混合液沖洗。緩沖液不得在色譜柱中過夜。注意：用緩沖液后不能直接換用有機溶劑

手動進樣器操作注意點：1）樣品溶液必須用0.45um的濾膜過濾2）進樣時，進樣針應插到底3）不使用時將針頭留在進樣器內4）進樣應使用液相色譜專用平頭進樣針5）轉動閥芯時不能太慢，更不能停留在中間位置6）樣品溶液pH小于10,常用密封墊的材質適用pH<10,否則換特氟隆材質的密封墊pH10-13定子轉子針頭密封墊彈簧不銹鋼套進樣器的保養(yǎng)進樣系統(tǒng)柱的保養(yǎng)8945612370xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx00000000LC-10AD:::::::輸液時不要打開排液閥柱子在任何情況下不能碰撞、彎曲或強烈震動分離系統(tǒng)當柱子和色譜儀連結時，閥件或管路一定要清洗干凈要注意流動相的脫氣避免使用高粘度的溶劑作為流動相進樣樣品要提純控制進樣量每天分析工作結束后，要清洗進樣閥中殘留的樣品每天工作結束后用適當?shù)娜軇﹣砬逑粗敺治鲋L期不使用，應用適當有機溶劑封柱保存柱的保養(yǎng)檢測器的保養(yǎng)紫外燈的保養(yǎng)：分析前，柱平衡差不多時，打開檢測器；在分析完畢后，先關紫外燈。（頻繁的開關燈會縮短燈的使用壽命）樣品池要保養(yǎng)1）用HPLC級溶劑2）過濾流動相和溶劑3）脫氣檢測系統(tǒng)第九節(jié)液相制備色譜制備色譜是以色譜技術來分離，制備較大量純組分的有效方法。1.色譜柱的柱容量分析型：不影響柱效

制備型：不影響收集物純度制備色譜色譜柱常常處于超載情況，柱效將大幅度降低，峰形變寬，分離變差，保留值也隨之改變。2.液相制備色譜方法3.液相制備色譜儀第十節(jié)毛細管電泳一、基本原理1、概述在電解質溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質的不同，遷移速率不同可實現(xiàn)分離。

毛細管電泳是以高壓電場為驅動力