第二章酶的分離和純化

IsolationandPurificationofenzyme

方法概括

原料處理：包括組織破碎、緩沖液抽粗分級：一般采用硫銨沉淀、乙醇沉淀或其他方法細分級：一般采用離子交換層析、凝膠層析、親和層析和電泳

1.2.

第一節

原料選擇及預處理

動物原料：動物組織或臟器（活體取出）

充分脫血

-10℃—-50℃保存植物原料：植物原料

磨碎

加入緩沖液抽提植物原料特點：1）纖維含量高

2）酚酶活力高

3）緩沖液pH易被細胞內物質改變微生物原料：菌體培養

做酶活—時間曲線

確定最大酶活時間

3.

細胞破碎

微生物細胞破碎一般采用

1）化學法：堿；去垢劑；有機溶劑；酶解；冰凍復融2）物理法：熱處理；滲透壓；減壓；聲波振蕩3）機械法：加磨料；研磨；擠壓4）緩沖液抽提抽提緩沖液的加入要少量多次，植物酶抽提時可加5mM的Vc4.

第二節酶的粗提沉淀

核酸沉淀：a）MnCl2、硫酸魚精蛋白、鏈霉素可使核酸沉淀，離心除掉（b）加入核酸酶將其降解雜蛋白沉淀：根據目的酶的特性方法各異選擇性沉淀（鹽析）：最常用的方法5.沉淀過程中隨時監測蛋白濃度和酶活力

討論：（a）鹽的加入速度合適（b）蛋白質開始沉淀處的硫銨濃度與蛋白濃度有關（c）硫銨濃度表示法；飽和度25℃4.1M（d）硫銨飽和溶液pH<7，若目的酶易酸變性必須用緩沖液（e）硫銨溶液密度較高（1.24），故需較大離心力此步可除去75%以上的雜蛋白，且可使蛋白濃縮6.

透析與濃縮

1）透析袋處理：透析袋

0.5MEDTA煮半小時

蒸餾水煮半小時

反復八次

帶橡皮手套用鑷子拿取2）透析除鹽：200倍于被透析物；4小時換一次透析液；監測電導值SephadexG25除鹽：柱長50cm；上樣小于床體積的20%3）濃縮：a）火棉膠

b）聚乙二醇（PEG）

c）超濾（3-5kg/cm2）d）凍干7.

透析技術原理圖8.

超濾技術原理圖

9.

第三節酶的精制

一、層析技術（chromatography）1）分配層析：物質在兩相中的分配系數不同a）紙層

b）薄層(比紙層靈敏100倍但剝板困難)c）柱層2）吸附層析（absorptionchromatography）：吸附劑對通過它的物質吸附力不同，吸附力包括離子引力、疏水作用、范德華力和氫鍵a）薄層

b）柱層填料一般為硅膠、氧化鋁、磷酸鈣、活性白土和羥基磷灰石；常用羥基磷灰石;帶正電,穩定范圍pH5.5-10,吸附量1mg/g濕劑10.

紙層11.

薄層12.3）離子交換層析（ionexchangechromatography）

：交換劑上帶電荷，可根據樣品的電荷予以分離a）陽離子交換層析

b）陰離子交換層析

c）離子交換劑的類型：離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠d）實驗室常用的離子交換劑：陰離子交換劑DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex；陽離子交換劑CM-Cellulose、CM-Sephadexe）離子交換劑的預處理：去雜質；溶脹；除小顆粒；改型陽離子交換劑：

堿→水→酸→水→平衡陰離子交換劑：

酸→水→堿→水→平衡13.f）柱層析：床體積等于2-5倍束縛樣品需要量；

徑∶高

=1∶15；

上樣量不超過柱體積的10%（*注意上樣方法）；洗脫方法有兩種——不連續梯度洗脫和連續梯度洗脫；分布收集器收集每管2-3mlg）交換劑后處理：飽和NaCl→水→酸或堿→水→平衡14.

連續梯度洗脫梯度混合器

15.

離子交換層析陽離子交換劑陰離子交換劑16.Anionexchangechromatography

17.4）凝膠層析（分子篩層析）（gelfiltrationchromatography）：根據分子量大小予以分離

a）凝膠預處理：凝膠→浸入洗脫液→輕輕攪拌↓

加熱90-100℃（水浴加熱）b）層析柱準備：φ2.5×100柱；稠膠灌柱；2-3個床體積的緩沖液平衡；流速16-18ml/hc）層析：蘭葡聚糖（分子量2×106）驗柱并求外水體積（V0）；上樣量1-5%；恒壓洗脫；流速16-18ml/hd）凝膠后處理：0.5NNaOH+0.5NNaCl處理后4℃保存長時間不用可采用乙醇脫水保存或低溫干燥保存18.

凝膠過濾層析原理圖

19.

Gelfiltrationchromatography

20.5）親和層析（affinitychromatography）

特異性結合a）關鍵：配體；配體與支持物的連接方法；吸附、洗脫條件b）支持物的選擇：非特異性吸附作用低；液體流動性好；較寬的pH、離子強度；豐富的化學基團；有效的多孔性常用瓊脂糖、聚丙烯酰胺凝膠和受控多孔玻璃球c）配體的選擇：有親和力但不易過大d）配體與支持物的連接：載體結合法；物理吸附法；交聯法；包埋法（先活化支持物上的功能基團再將配體連上去）e）

吸附劑的衍生物：支持物+空間臂f）

層析條件的選擇：蛋白質+配體→蛋白質-配體復合物起初配體濃度恒定，隨蛋白濃度增加平衡右移（逐漸保留特性），故親和力較低也能成功的親和。

g）洗脫：更高親和力的物質置換；劇烈改變環境條件21.

親和層析原理22.Affinitychromatography

23.二、超離心技術

利用物質的沉降系數、質量、浮力因子等方面的差別用強離心力進行分離F=w2r（F—

相對離心力RCF；RCF以g的倍數表示）

RCF=w2r/980w=π(轉數/分）/30RCF=1.119×10-5r(轉數/分)2離心機：a)

桌式：3000轉/分紅血球、酵母細胞等粗沉淀物b)

高速離心機：20000–25000轉/分一般實驗使用但病毒、小細胞器或單個分子不能沉降c)

超速離心機：75000轉/分分子生物學必備；能分級只有在電鏡下才能看得見的亞細胞器24.

二、電泳（electrophoresis）技術

1）原理：M=dL/EtM:遷移率

L:顆粒泳動距離

t:通電時間

E:電勢差遷移率與下列因素有關：a）樣品帶電狀態、分子形狀與大小

b）電場強度c）緩沖液pH的和離子強度

d）支持介質的阻力、吸附作用2）電泳類型：a）紙電泳

b）醋酸纖維薄膜電泳

c）瓊脂糖電泳

d）聚丙烯酰胺凝膠電泳25.PAGE和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：Acr+Bis；TEMED，0.4%；過硫酸胺,0.01-0.03%；等電聚焦(isoelectricfocusing)：兩性電解質在電場作用下建立一個pH梯度分離蛋白質電泳檢測：a）考馬斯亮蘭（氨基黑）染色法

b）熒光染色法

c）特異酶檢測

d）其他染色法26.

盤狀電泳（A）和平板電泳（B）

27.

第四節提純過程中的定量

蛋白質濃度：1）雙縮脲法：Cu++與肽鍵及酪氨酸殘基絡合顯色；測定濃度0.5-10mg/ml2）Lowry法：雙縮脲法的改進，Cu++與蛋白質在堿性溶液中絡合，此絡合物還原Folin試劑，測定濃度20-400μg/ml3)紫外吸收法：Tyr、Trp、

Phe在280nm有最大光吸收，此方法因上述三種氨基酸含量不同測定結果有誤差

測定濃度0.1-0.5mg/ml4）Bradford法:該法是根據蛋白質與考馬斯亮藍（coomassiebrilliantblue）結合產生的藍色物質在595nm有最大光吸收來測定蛋白質濃度的。該方法簡單、快速、可靠、靈敏度高，可測定1-10mg的蛋白質。酶活力：檢測目的酶的活力目的蛋白（非酶）檢測較困難28.純化倍數

=回收率%=×100

29.

酶的提純過程記錄格式

步驟總體積（ml）蛋白總量（mg）總活力（u）比活力（u/mg）回收率（%）提純倍數粗抽提液

50℃熱變性除雜

硫銨分級沉淀（30%-50%）

DEAE-纖維素離子交換

凝膠過濾SephadexG-1001000

1000

250

25

1012000

8000

750

35

9.25000

48000

2730

1820

17000.416

0.80

3.67

52

185100

96

55

36.4

341.00

1.44

8.83

125

44430.第五節酶蛋白分子量的測定滲透壓法

超速離心法凝膠層析法

SDS-聚丙烯酰胺電泳法

31.

滲透壓法M為蛋白質的摩爾質量（分子量），R為氣體常數（0.082升·大氣壓/摩爾/度），T為絕對溫度。為了測定蛋白質的分子量，分別取幾個不同的蛋白質濃度c，測出對應的滲透壓π，然后以π/c對c作圖，并作延長線外推至c=0，得到的y軸截距即為limπ/c的值，代入上式可求得分子量M。滲透壓法適合測定分子量范圍在10,000～100,000的蛋白質。其優點是實驗裝置簡單，測定也較為準確；缺點是要求蛋白樣品純度高，否則測出的將是溶液中各種蛋白的平均分子量。32.

超速離心法M：分子量

S：沉降系數

R：氣體常數

T：絕對溫度

D：擴散系數

υ：溶質分子微分比容ρ：介質密度33.

SDS-聚丙烯酰胺電泳法M——

被測蛋白分子量a，b——

常數，用已知分子量蛋白作標準曲線求得

de——

酶蛋白的泳動距離

do——

小分子染料的泳動距離亞基分子量34.SDS的分子量標準曲線

35.

凝膠層析法M——

被測蛋白分子量a，b——

常數，用已知分子量蛋白作標準曲線求得

Ve——

酶蛋白洗脫體積

Vo——

空體積（可用藍葡聚糖求得）36.

凝膠過濾分子量標準曲線

37.思考題下表是一種酶的各個純化步驟的總蛋白和總活性單位數。⑴．從表中給出的信息計算每一純化步驟得到的酶溶液的比活；⑵．哪一純化步驟最有效（即相對純度增加最大）；⑶．哪一純化步驟效率最低？按照表中的6個步驟純化的酶是純化的酶，表中結果是否有指示？有沒有別的方法評價酶的純度？

38.39.作業請說明酶純化過程中常用的分離技術。從肝細胞中提取的一種蛋白水解酶的粗提液300mL含有150mg蛋白質，總活力為360單位。經過一系列純化步驟以后得到的4mL酶制品（含有0.08mg蛋白），總活力為288單位。整個純化過程的收率是多少？純化了多少倍？40.后面內容直接刪