前列腺癌的免疫組化標記物1整理課件1前列腺特異性抗原前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen，PSA)是分子量34000的單鏈糖蛋白，由237個氨基酸構成，它是一種絲氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作為前列腺腺上皮細胞的標志物被發現的。血清PSA目前已被廣泛應用于前列腺癌的早期篩查。2整理課件PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮內瘤，均呈陽性表達，定位于上皮細胞的胞質中，而在前列腺轉移癌那么呈陰性表達，因此PAS陽性提示腫瘤來自前列腺上皮，可用于區分前列腺癌與前列腺轉移癌[5]。PSA在前列腺良、惡性病變中均呈陽性表達，故PSA不能用于鑒別良惡性病變。幾乎所有的前列腺癌〔除了分化最差的癌和少數激素治療后復發的進展期癌以外〕PSA標記都陽性，而高分化前列腺癌的PSA表達強于低分化前列腺癌,說明PSA表達與分化程度有關。而對于分化很差的癌，即使PSA陰性也不能完全排除前列腺癌，還要結合其他檢查綜合考慮。偶爾PAS陽性可出現在前列腺以外的組織和腫瘤，但一般為局灶性弱陽性[6]。3整理課件[5]HarveyAM,GriceB,HamiltonC,eta1.Diagnosticutilityofp504s/p63cocktail,prostate-specificantigen,andprostaticacidphosphataseinVerifyingprostaticcarcinomainvolvementinseminalVesicles:astudyof57casesofradicalprostatectomy,specimentsofpathologicstagepT3b[J].ArchPatholLabMed,2021,134(7):983-988.[6]BostwickDG,QianJ,RamnaniDM.Immunohistochemistryoftheprostateandbladder,testisandrenaltumors.In:DabbsDJ,ed.DiagnosticImmunohistochemistry.Philadelphia:ChurchillLivingstone,2002.407-334整理課件CK34βEl21984年，Gown等[7]首先報道了CK34βEl2，它是一種高分子量57000～66000的細胞角蛋白。CK34βEl2標記良性前列腺組織，僅在前列腺基內幕胞的細胞膜以及細胞質中表達，而不在前列腺分泌上皮細胞表達，故CK34βEl2可作為對前列腺的基內幕胞層進行選擇性的標記[8]。由于基內幕胞消失是診斷前列腺癌的重要形態學依據，而蘇木素-伊紅染色切片判斷基內幕胞是否存在常十分困難，因此用CK34βEl2標記基內幕胞就成為前列腺良惡性鑒別診斷的重要手段之一。5整理課件在正常和良性增生以及上皮內瘤的前列腺腺體，導管周圍形成連續或斷續的CK34βE12分布。而前列腺癌的腺體的基內幕胞層完全消失，所以最終表現為CK34βE12不表達。但CK34βE12標記基內幕胞可局部陰性，對經尿道電切的標本，常因標本經人為燒灼而受影響，因此可靠性和穩定性欠佳。有20%～30%的前列腺癌導管腺癌和篩狀癌周圍有連續或間斷的基內幕胞，而局部良性前列腺病變,如腺病和不完全性萎縮的腺泡周圍基內幕胞可局部甚至完全消失。說明基內幕胞消失并非診斷前列腺癌的絕對指標。而免疫組化操作不當，那么有可能出現假陰性結果而誤診。故免疫組化結果應結合HE切片中的其他形態學特征綜合判斷。6整理課件P631998年，Okada等[9]別離出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成員，位于人類染色體3q27-29。P63能特異性地標記前列腺基內幕胞，呈胞核陽性，棕黃色顆粒狀，故而可以顯示基內幕胞的存在，而前列腺的分泌上皮細胞那么呈陰性[10]。絕大多數的前列腺良性增生及低級別上皮內瘤的腺體的周圍呈現連續性的P63分布；而高級別上皮內瘤可見P63不同程度的間斷消失，而前列腺癌中腺體周圍P63為陰性，顯示基內幕胞已經完全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鑒別診斷。7整理課件CK34βE12、P63均可用于標記基內幕胞，而作為診斷前列腺癌的有力手段。P63與CK34βEl2相比，具有以下優點：①局部CK34βE12標記陰性的基內幕胞，P63標記可呈陽性；②對有燒灼的經尿道電切的前列腺標本，P63標記結果比較穩定。③P63標記基內幕胞呈核陽性，結果容易判斷，背景比較清晰。缺點那么是其陽性表達是間斷的，當可疑腺泡少時，判斷其基內幕胞是否消失有時比較困難。在實際應用中，兩者具有互補作用。8整理課件基內幕胞消失是前列腺癌的重要診斷依據，但局部的基內幕胞缺失卻不能作為診斷前列腺癌的唯一標準。由于前列腺癌可有殘留的基內幕胞，而且浸潤性癌在管腔內擴散及良性腺體陷入癌組織中[11],因此個別前列腺癌中CK34βEl2與P63亦有陽性表達。少數前列腺增生病變基內幕胞標記亦呈陰性表達，說明少數前列腺良性腺體基內幕胞可以不連續或不能被證實存在，這也提示基內幕胞免疫標志物陰性不能單獨作為確診惡性的指標。9整理課件α-甲基-輔酶A-消旋酶(P504s)2001年Jiang等[12]首次將P504s抗體應用于前列腺癌的診斷。P504s即α-甲基-輔酶A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoAracemase)，其基因定位于染色體5P13，它所編碼的蛋白由382個氨基酸組成，在支鏈脂肪酸的β-氧化和衍生過程中起作用。P504s在前列腺癌中高表達，而在正常中前列腺組織中那么呈陰性或灶性弱陽性。Jiang等在所檢測的137例前列腺癌中陽性率高達100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特異性的標記物。10整理課件P504s陽性，CK34βEl2和p63陰性，能從正反兩面支持前列腺癌診斷，從而大大提高前列腺癌的診斷正確率[13]。然而，臨床上并非所有的前列腺癌都是P504s陽性，CK34βEl2及p63陰性，也并非所有的前列腺良性病變都是P504s陰性，CK34βEl2及p63完整陽性。楊京哲[14]等人的試驗中，P504s不僅在前列腺癌中有高表達，而且在前列腺上皮內瘤中也高表達，這說明P504s不但對前列腺癌敏感，并且對PIN也非常敏感，故用P504s只能區別前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鑒別開來。11整理課件2004版WHO中，P504s在前列腺癌的陽性率為80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫狀腺癌、萎縮性癌、假增生性癌和治療后前列腺癌中陽性率比較低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎縮型腺體以及90%以上的高級別PIN中呈陽性反響。此外，P504s在前列腺以外的腫瘤如尿路上皮癌、結腸癌、腎癌以及良性腎源性腺瘤也可陽性。這說明P504s沒有組織特異性，不是前列腺癌的特異性標志物。12整理課件綜上所述，免疫組化在前列腺癌診斷中的應用具有重要價值，但決不能完全依靠免疫組化去診斷前列腺癌，單獨的P504s(或基內幕胞標志物)陽性或陰性均不能確診前列腺癌。只有將組織病理形態與免疫組化染色結果結合起來，全面分析，綜合判斷，才能有效地防止誤診。13整理課件免疫酶細胞化學實驗技術---實用免疫細胞與核酸技術〔周德山〕免疫酶細胞化學是免疫細胞化學〔Immunocytochemistry,ICC〕中最常用的方法之一，它是在抗原抗體特異反響存在的前提條件下，借助于酶細胞化學的手段，檢測某種物質〔抗原/抗體〕在組織細胞內存在部位的一門新技術：即預先將抗體與酶連結，再使其與組織內特異抗原反響，經細胞化學染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態學研究方法。14整理課件為克服熒光抗體法的缺乏、并能在超微結構水平定位抗原物質的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替熒光色素標記抗體，進行組織細胞內抗原或半抗原的定位，開辟了酶標抗體技術免疫酶細胞化學之路。結合筆者經驗，介紹ICC染色中的主要程序：組織標本的固定、切片、染色原理及步驟、結果判定及一些進展、特殊應用等供讀者參考。15整理課件第一節固定和切片一、固定假設想得到理想的ICC染色結果、正確地判斷抗原物質在組織細胞內的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細胞內抗原物質的不動性〔Immobility〕和免疫活性也是至關重要的。換言之，如果抗原物質在組織細胞間彌散、喪失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環。ICC與其它組織學技術不同，除要求保存良好的結構外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結構較差，易出現抗原彌散喪失現象。16整理課件Cumming〔1980〕報告，不固定的組織切片ICC染色時，環鳥苷酸含量喪失80%以上。固定的目的是使構成組織細胞成分的蛋白等物質不溶于水和有機溶劑，并迅速使組織細胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細胞的完整性和所要檢測物質的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時應根據所要檢測物質的抗原性質和切片方法以及所用抗體特征等做最正確篩選。制片及固定方法見第一章，下面介紹兩種近年報道的新方法。17整理課件1．AMEX〔AcetoneMethEnzoateXylene〕法是改進的冰凍置換法〔freezesubstitution〕的簡稱，主要用于石蠟包埋標本。Sato(1986)報告，該法具有同新鮮〔未固定〕組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結構保存。其機制為：組織在丙酮中固定〔脫水〕，組織細胞內水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內丙酮，經二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內參加少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點石蠟包埋等，可獲得更佳染色結果。18整理課件微波固定〔Microwavefixation〕為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結構和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波〔頻率1000～3000MHz〕具有被水分吸收的性質〔通常所用的微波是頻率2450MHz，波長12cm〕；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運動加快，促進固定液向組織內滲透，加速與組織成分的反響，短時間內到達固定的效果等有關。經微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續固定2～6h，室溫。19整理課件二、切片光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優缺點，應根據抗原的性質、實驗室條件，合理選擇之。對未知抗原顯示時，最好同時應用。冰凍切片為ICC研究所首選。20整理課件Shi〔1991〕等報告：微波爐照射的切片，能夠激活局部核內抗原活性。其機制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，參加去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復屢次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補充瓶中蒸發掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細胞核染色以蘇木精為佳21整理課件第二節染色方法一、本科標抗體法酶標抗體技術是通過共價鍵將酶連結在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞外表及細胞內各種抗原成分的定位。22整理課件〔一〕酶的種類及特點從理論上講，用細胞化學方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多。現將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。23整理課件24整理課件Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產物沉淀必須穩定，即終產物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應穩定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應改變，且酶的催化活性〔Turnover〕越高越好；⑤酶標過程中，酶與抗體連結，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應存在與標記酶相同的內源性酶或類似物質。25整理課件〔二〕本科標抗體的制備〔Boosma,DM,1983〕酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯劑的作用，將酶連結在抗體分子上。偶聯劑是一種雙功能試劑，具備3個根本特征：①偶聯劑與抗體和酶之間的連結，必須是不可逆的，即借共價鍵連結；②偶聯劑不應影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯劑的參加，使酶與組織成分了生非特異結合。抗體制作步驟未列出26整理課件〔四〕染色原理及步驟1．根本原理酶標抗體與熒光色素標記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標記在每一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。間接法所用的第一抗體是對組織細胞內某種抗原的特異性抗體〔80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數單克隆抗體系由小鼠制備〕；第二抗體那么為第一抗體〔家兔/小鼠的IgG〕的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可防止了直接法中標記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。27整理課件2．染色程序〔1〕切片準備：見第一章。①石蠟切片經二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫枯燥2h以上。〔2〕未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval)，簡而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯造成的空間遮蔽〔室溫〕，風干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據需要可進行組織抗原的激活。28整理課件〔3〕用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以防止孵育液流失及孵育過程中切片枯燥，同時也能節省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風干。石蠟切片〔滴少量PBS，以防其枯燥〕直接進行步驟〔6〕。〔4〕切片經PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應用ALP標記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。〔5〕根據需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min〔室溫〕，封閉內源性過氧化酶的活性。應用ALP標記抗體時，此步可省略。29整理課件〔6〕PBS漂洗2min〔共兩次〕，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%TritonX-100)中5min〔室溫〕。Tween-20為一種外表活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內抗原的顯示。〔7〕4%BlockAce或0.1%～1%BSA濕盒內孵育15～25min〔室溫〕，然后；輕輕棄去孵育液〔不沖洗〕；以阻斷組織與抗體的非特異性結合，降低背景染色。〔8〕根據需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20min〔室溫，以酶標抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動物免疫前的血清〕。或者省略此步，而在稀釋酶標抗體時，參加1%～2%的同一種屬正常血清。30整理課件9〕輕輕棄去孵育液，滴加含0.2%BSA/0.05NaN3/PBS稀釋的第一抗體〔抗體用量：每張切片一般為50～80μl〕，濕盒內孵育1～2h〔20～25℃〕；免疫電鏡用標本，4℃過夜。〔10〕PBS充分沖洗〔3次×2min〕，以去除切片上非特異吸附的抗體。應用不同的第一抗體或同時進行對照標本染色時，需分別沖洗，以防相互污染。〔11〕經0.05%Tween-20/PBs2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標記的第二抗體,濕盒內孵育45～60min(20～25℃)。31整理課件〔12〕PBS漂洗〔3次×2min〕,此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標抗體孵育。〔13〕未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min〔室溫〕此時輕微固定，既不影響抗原抗體結合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。32整理課件〔14〕呈色：HRP標記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O20.01%～0.05%DAB0.05～0.1mol/LTris–HCl(pH7.4)。切片經PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內10～15min〔室溫、暗處〕，亦可鏡下控制顯色速度。終產物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標本，呈色3～5min即可，防止DAB終產物向周圍擴散，影響超微結構定位。另外，顯色液應于用前新鮮配制，防止DAB本身氧化變質。新配制的DAB為無色透明液體。假設DAB液已氧化變為紫紅色，應換新藥重新配制。〔15〕將切片置流水中〔僅光鏡觀察〕