第一局部DNA提取總論一、提取DNA總的原則：1保證核酸一級構造的完整性；2其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；3核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；4其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。二、樣原來源：理論上全部有核真核細胞、細菌、病毒都可以提取DNA樣本選擇取決于試驗目的全血是基因組提取最常見的樣本血清、血漿、外周血有核細胞、痰液、體液、棉拭子采集的各種分泌物、組織〔包括骨髓〕和羊水等都是分子診斷的檢驗材料，其中全血、血漿〔血清〕標本占分子診斷的60%以上DNA提取前樣本采集、預處理和保存：〔一〕全血1.抗凝劑EDTA-Na2或枸櫞酸鈉作為抗凝劑不宜使用肝素抗凝劑處理血肝素檸檬酸*EDTA*-80℃保存2個月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室溫提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差〔二〕血漿和血清血漿和血清是檢測釋放入血的游離核酸最主要的標原來源，用來檢測病毒、細菌，以及腫瘤細胞等等釋放出來的游離核酸和蛋白質產物，在臨床上被廣泛應用于病原微生物和腫瘤標志基因的檢測.三、DNA的收率樣本類型基因組DNA收率20mg肝臟組織8

g100mg豆苗10

g100

l全血2

g2

106培養細胞10

g四、DNA提取的根本步驟1、核酸的釋放：裂開細胞釋放核酸〔機械法與非機械法〕2、核酸的分別與純化3、核酸的濃縮、沉淀與洗滌4、DNA鑒定：濃度鑒定純度鑒定完整性鑒定

五、DNA提取試驗中常遇到的問題基因組DNA收率較低或無基因組DNA樣本材料太少細胞裂開不夠充分，DNA釋放不完全離心力偏小兩相分別不完全……DNA降解的緣由樣本不夠新穎，采集材料過陳舊樣本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的緣由？提取的基因組DNA鹽濃度過高基因組DNA中乙醇未去除凈基因組DNA中可能存在其他抑制因素提取基因組DNA，有時參與蔗糖的緣由參與多糖，疼惜DNA長度不行無視的細節

—血液基因組提取天根生化科技〔北京〕沒有嚴格要求:PCRSouthernBlotsRFLP嚴格要求片段長度:

構建文庫

PFGE(脈沖場凝膠電泳)DNALengthDNA提取原則1：DNA片段長度沒有嚴格要求

常規PCR嚴格要求產物純度存檔、產物長期保存Southern雜交熒光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比較基因組雜交)DNA提取原則2：DNA產物純度基因組提取方法溶液鹽析法：無需酚氯仿，樣本量靈敏可變，得率高硅膠膜吸附法：利用硅膠膜特異吸附核酸的原理來純化核酸磁珠法：獨特包埋的磁珠，在確定條件下對核酸具有很強的親和力，而當條件轉變時，磁珠釋放吸附的核酸，能夠到達快速分別純化核酸的目的。傳統酚氯仿法：傳統方法，抽提時間長，本錢低。但酚氯仿有毒，危害身體安康。樣本保存和前處理－抗凝血液保存檸檬酸、EDTA、肝素三種抗凝劑均可使用。但肝素對酶反響有可能起阻害作用,采血時如沒有特殊要求,請使用檸檬酸或EDTA處理血樣。

參與抗凝劑混勻后2-8℃保存一周；－20℃保存一個月；－70℃長期保存。盡可能保證樣本不經過反復凍融。樣本前處理1.凍存的抗凝血液使用前溶解應在37℃水浴快速溶解。

2.抗凝血提取前需要徹底混勻后再吸取試驗所需的體積。樣本保存和前處理－非抗凝血保存非抗凝血即血凝塊。-20℃保存一個月；-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經過反復凍融。樣本前處理

1.凍存的血凝塊使用前應在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

2.血凝塊取出后先實行機械裂開的方法〔例如：放入無粉橡膠手套中捏碎或勻漿〕將血凝塊裂開，然后再依據自己的試驗取適量樣本。血凝塊前期裂開程度越高，提取基因組就越簡潔！樣本保存和前處理－白膜層保存全血分別得到的白膜層放置-20℃或-70℃長期保存。盡可能保證樣本不經過反復凍融。樣本前處理1.白膜層是將全血離心取中間層所得。白細胞則是用紅細胞裂解液裂解紅細胞后得到的沉淀。

2.凍存的白膜層使用前應在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

3.雖然得到的是白膜層，但是會有少量紅細胞存在，所以紅細胞裂解液還是必要的，但用量減半。4.承受白膜層提取核酸時，所用到的提取溶液體積需依據全血體積進展操作。即：1ml全血得到的白膜層提取時需要參與提取1ml全血的試劑量。樣本保存和前處理－血清/血漿保存現在很多科研者使用血清/血漿提取游離核酸進展爭論，例如：腫瘤爭論。分別得到的血清/血漿放置-70℃保存。盡量避開樣本反復凍融。樣本前處理

1.凍存的血清/血漿使用前溶解應在37℃水浴溶解，輕柔顛倒混勻。

2.血清/血漿核酸提取時無需紅細胞裂解。

3.只需100-200ul樣本，根本能滿足下游常規PCR或熒光定量PCR檢測。樣本保存和前處理－微量血液/干血點/羊水/胸水保存微量血液：抗凝血液-20或-70℃保存；

干血點：枯燥后室溫或4℃保存；

羊水：-20或-70℃保存。樣本前處理

1.微量血液處理同抗凝血液，不同之處是無需進展紅細胞裂解步驟。

2.干血點參與緩沖液直接進展提取。

3.羊水/胸水提取時先離心得到沉淀，再進展裂解提取核酸。樣本保存和前處理－口拭子/漱口水保存口拭子：枯燥后室溫保存

漱口水：4℃保存或離心得到沉淀-20℃或-70℃保存樣本前處理

1.拭子將拭子棉頭剪入到離心管里，參與緩沖液直接進展提取。

2.有些拭子的棉頭剪不下來，可以將拭子在生理鹽水里漂洗幾次，離心得到沉淀再進展核酸提取。

3.漱口水先進展離心得到沉淀再進展核酸提取。基因組提取流程加入吸附柱緩沖液漂洗DNA洗脫收集樣本裂解純化去蛋白沉淀核酸洗滌去鹽溶解DNA沉淀樣本裂解溶液法〔鹽析法〕吸附柱法紅細胞裂解哺乳動物血液的紅細胞中沒有細胞核且核酸酶含量豐富，所以裂解紅細胞對核酸提取特殊重要。紅細胞裂解有兩種方式：承受紅細胞裂解液進展裂解〔通常紅細胞裂解液依據3倍全血體積參與進展裂解).承受細胞裂解液進展裂解〔TIANGEN的細胞裂解液CL是依據2.5倍全血體積〕，細胞裂解液將紅細胞裂解的同時可以裂解白細胞，得到的為細胞核沉淀，更便利基因組DNA的提取。紅細胞裂解充分的現象：

得到的沉淀應為白色沉淀或淡粉色沉淀。有時血液需要進展兩次裂解，留意其次次參與裂解液后需要將沉淀votex徹底混勻。核細胞裂解假設有裂紅的步驟，請盡量將上清去除再參與裂解液。參與裂解液〔如：TIANGEN試劑盒中的GB或FG〕和蛋白酶K需要徹底混勻。將沉淀打散混勻后再進展水浴。水浴時看到溶液變清，沒有粘稠物或沉淀時即可進展下步操作，通常水浴時間10-30min.假設承受有機〔酚/氯仿〕抽提時應充分混勻，動作要輕柔。離心分別兩相時，應保證確定的轉速和時間，且吸取上清時留意不要吸取到中間層及有機相。核酸吸附或沉淀硅膠膜吸附法

1.參與乙醇顛倒混勻后可能會消逝絮狀沉淀，動作要輕柔。

2.將裂解的溶液和絮狀沉淀全部參與到吸附柱里，此時的溶液應是高鹽低pH值的。通過硅膠膜特異吸附核酸的特性將裂解溶液中的核酸吸附到硅膠膜上。溶液法

1.當沉淀時間有限時，用預冷的異丙醇沉淀，沉淀會更充分。

2.參與異丙醇顛倒混勻后應消逝絲狀沉淀，動作要輕柔，避開基因組因過于猛烈的外力而降解。

3.分別沉淀的方法：a.用槍頭留神地將絲狀沉淀挑出；b.離心分別，應保證確定的轉速和時間。核酸洗脫或溶解硅膠膜吸附法

1.用去蛋白液、漂洗液將膜上的核酸漂洗后，將不加溶液的吸附柱離心以去除殘留的液體及揮發乙醇成分。參與適量洗脫液TBbuffer〔或自己配制的buffer〕后放置5-10min后再進展離心得到基因組DNA。溶液法

1.使用70-75％乙醇對核酸沉淀進展洗滌。溶解DNA前需要室溫或37℃放置幾分鐘晾干核酸〔使乙醇揮發〕，然后再參與適量的TBbuffer〔或自己配制的buffer〕溶解DNA。濃度：100－300ng/ul純度：任何雜質都可能導致DNA在儲存過程中的降解，因此要確保純化得到的核酸的純度。溫度：純化得到基因組DNA之后需將DNA溶液分裝保存到-20℃，反復凍溶會導致DNA的降解。溶解DNABuffer：純化得到的基因組DNA最好溶解在TBBuffer(TIANGEN)或者Tris緩沖液里，由于大片段的基因組DNA在酸性水溶液中不穩定，易水解。核酸保存純度〔OD260-320/OD280-320〕紫外分光光度計進展測量〔選擇正確的稀釋倍數，確保OD260值在0.1~1.0之間，通常離心柱法稀釋4－5倍；溶液裂解法稀釋20－30倍〕

OD260-320/OD280-320<1.7說明有蛋白的污染

OD260-320/OD280-320＝1.7～1.9說明純度很好

OD260-320/OD280-320>1.9說明有局部降解或有RNA污染得率紫外分光光度計進展測量

Yield＝OD260×50ng/ul×稀釋倍數DNA檢測方法－紫外分光光度法Tiangen產品提取得率產品具體細節請直接點擊產品名稱樣本處理量DNA/RNA得率（μg）推薦試劑盒哺乳動物全血100μl2DP327-磁珠法基因組提取試劑盒DP316-微量樣品基因組DNA提取試劑盒200μl4-12DP318-血液基因組提取試劑盒(0.1-1ml)600μl12-201ml4-30DP319-血液基因組提取試劑盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽類、兩棲類全血5-205-40DP318-血液基因組提取試劑盒(0.1-1ml)血凝塊200-500ul1-8DP318/DP319500-1000ul8-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子1個0.5-3.5DP322-口腔拭子基因組提取試劑盒DNA檢測方法－電泳檢測取2μl洗脫液1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測DNA分子大小，純度以及完整性TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒提取一樣血樣不同起始體積的DNA電泳圖電泳檢測要把握上樣量。上樣量過大會導致泳道過亮、拖尾等現象，影響正確推斷。假設加樣孔里有亮帶，說明有蛋白污染。假設上樣量適宜，泳道有彌散、拖尾現象，說明書基因組DNA有降解。TIANamp微量樣本基因組DNA提取試劑盒樣原來源全都，分別取1μl，10μl，50μl，100μl為起始樣本提取基因組。各取2μl基因組DNA為模板，擴增GAPDH基因，熒光定量PCR分析試驗結果。DNA檢測方法－熒光定量PCR檢測微量樣本基因組DNA的檢測通常承受熒光定量PCR檢測，例如：干血點、微量血液等。試劑選擇指南硅膠膜吸附法微量樣本（DP316）口拭子（DP322）