1食品安全國家標準食品微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗NationalfoodsafetystandardFoodmicrobiologicalexamination:ExaminationofClostridiumbotulinumandbotulinustoxin

GB4789.12-2016第六章：致病性芽孢桿菌檢驗及原理2016-12-23發布

2017-06-23實施第一部分：

概述1菌體形態學

專性厭氧性G+周身鞭毛網球拍樣梭狀芽孢大桿菌.2菌體抵抗力

繁殖型菌體：一般，45℃以上都受到抑制，100℃經10min即可殺死

芽胞型菌體：超強，煮沸后要6h，120℃經4－5min才能殺死。3肉毒梭菌分布很廣－－世界各地、各處都有。

Purecultureofthesporeformingbacterium

Clostridiumbotulinum[1,250x].

34致病性

有食物中毒和感染中毒兩類

潛伏期：2h-12-36h-數日食物中毒：食物中毒的一般癥狀：頭痛、頭昏、腹痛、惡心、嘔吐等；后出現肉毒梭菌毒素中毒的特征性癥狀－－神經麻痹，先眼部、頭頸部－全身骨骼肌麻痹－－似睡狀，不能抬頭、除視覺外，其他感覺正常。呼吸肌麻痹死亡。

感染中毒：外傷、注射吸毒等，感染菌體，在傷口適宜條件下菌體繁殖產毒－－中毒。45肉毒毒素能產生“劇毒神經麻痹肉毒梭菌外毒素”（1）毒素分型和媒介按抗原特異性分7（8）個型－－A、B、C（Cα和Cβ）、

D、E、F和G。各型肉毒毒素所致疾病及其媒介5（2）毒素毒性是目前所知的最強烈的細菌外毒素，有A-F7個型

A型毒素毒性最強(人最敏感),是目前已知的化學毒物及細菌毒素中毒性最強的一種：其毒性比氰化鉀強１萬倍，比響尾蛇毒素(crotactin)約強10萬倍，對人的最小致死量為１０－７g（0.1－lPg）；1g此精制毒素可殺死體重20g的小鼠２×１０１０只。戰爭狂人已將其作為細菌戰劑，必須加強戒備。我國有A型、C型、E型和D型

6（3）中毒機理

劇毒肉毒毒素肉毒素進入血液循環后，選擇性地作用于運動神經與交感神經的神經末梢，抑制神經傳導介質乙酰膽堿的釋放，因而引起肌肉運動障礙，發生軟癱。醫學上利用麻痹肉毒素美容、治肌肉痙攣性收縮病癥。www.cho-obgy.co.kr

7很強：

耐蛋白酶：不被胃液或消化酶所破壞，胰蛋白酶可活化毒素耐酸：在pH3－6范圍內毒性不減弱對堿敏感：在pH8.5（1％NaOH）以上可破壞毒性對熱：100℃經10—20min常被破壞。保存：毒素在干燥密封和陰暗的條件下，可保存多年。類毒素：用0.3%-0.5%甲醛處理后消除毒性并保持抗原性的外毒素即變為類毒素,可用于預防相應外毒素中毒。（4）肉毒梭菌毒素抵抗力8（5）肉毒梭菌產生肉毒毒素的條件食品自然產毒條件：污染的、在厭氧條件下制造或保存的食品，發酵或腐爛變質的食品，具營養、溫度25－30℃、pH6－8、厭氧、水分活度≧0.85的條件，即可產生毒素。

9（6）罐頭等包裝食品有效控制肉毒毒素產生的措施能夠抑制A、B、E及F型肉毒梭菌的芽孢出芽和產生毒素的條件：高壓120℃5min以上（高壓滅菌）；pH≦4.6（酸化食品）；水分活度≦0.85（干制品）；鹽分含量≥20%(腌漬食品)；巴氏殺菌＋冷藏（蟹肉及魚糜制品）；干燥＋冷藏；上述多種方式聯合。106培養

肉毒梭菌為專性厭氧菌最適生長溫度：28－37℃生長良好

最適產毒素溫度為25—30℃最適pH為6-8(在8℃以上，pH4以上都可形成毒素)在普通固體培養基上，形成R型菌落，常擴展成菌苔。

desk/product/images/1000000000041.jpg117肉毒梭菌的生化特性

分解葡萄糖、麥芽糖及果糖，產酸產氣明膠液化＋緩慢液化凝固血清(37℃，15d)，使牛乳消化，硫化氫＋，硝酸鹽還原－。＋12第二部分國標13前言本標準代替GB/T4789.12—2003《食品衛生微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗》。本標準與GB/T4789.12—2003相比,主要變化如下:——標準名稱修改為“食品安全國家標準食品微生物學檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗”;——增加了PCR鑒定方法;——增加了結果與報告;——增加了附錄A;——修改了設備和材料;——修改了培養基和試劑;——修改了檢驗程序;——規范了樣品制備過程;——修改了操作步驟中增菌和分離培養部分試驗方法。141范圍本標準規定了食品中肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)及肉毒毒素(botulinumtoxin)的檢驗方法。本標準適用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2設備和材料2.19PCR反應管。2.20無菌注射器:1.0mL。2.21小鼠:15g~20g,每一批次試驗應使用同一品系的KM或ICR小鼠153培養基和試劑3.1庖肉培養基：:見A.1。

－－增菌用，含牛肉碎塊、葡萄糖和淀粉等的液體或半流動培養基－－A、B型肉毒梭菌生長旺盛，而且表面渾濁，產大量氣體，底有粉狀或顆粒狀沉淀，并能消化肉塊，變黑有臭味。3.2胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯(TPGYT):見A.2

肉毒毒素培養基3.3卵黃瓊脂培養基：:見A.3

鑒別培養基:含葡萄糖和卵黃:本菌含脂肪酶，分解脂肪，產生甘油，使菌落及其周圍表面覆蓋著特有的彩虹樣(或珍珠層樣)薄層163.4明膠磷酸鹽緩沖液：見A.4

－－處理稀釋樣品用，明膠起穩定毒素作用。3.5革蘭氏染色液:見A.5。G+3.610%胰蛋白酶溶液:見A.6：

肉毒毒素耐受3.10肉毒分型抗毒診斷血清：分型3.11無水乙醇和95%乙醇。3.1210mg/mL溶菌酶溶液。3.1310mg/mL蛋白酶K溶液。3.143mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)。3.15TE緩沖液。3.16~3.25：PCR材料174檢驗程序肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序見圖1腹腔注射小鼠增菌培養G+***

肉毒梭菌檢驗有芽胞大桿菌毒素基因檢測*

TPGYT:胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉湯*186、說明

1）毒素檢測：檢測的目的：就是以檢出肉毒毒素為標準（可進一步定型）有特殊需要時再分離鑒定菌。（1）肉毒毒素檢出試驗（有無）：小白鼠腹腔注射法為標準方法。（2）確證試驗（定性）（3）毒力測定（強弱，選做）（4）毒素定型和菌體型試驗（選做）19（1）肉毒毒素檢出試驗：小白鼠腹腔注射法為標準方法。

0.5mL樣品上清液和胰酶激活處理液/只－各注射小白鼠3只。試驗結果：

0.5h內猝死：稀釋重做；

6h內死亡：典型癥狀：豎毛、四肢癱軟，呼吸困難，呼吸早呈箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。初步確定+

24h以后發病、死亡：樣品濃縮、重做。20

（2）確證試驗：取致死樣上清液分成三份

上清液＋等量多型抗毒素血清－混勻－37℃，30min－－0.5mL接種小鼠上清液＋等量明膠磷酸鹽緩沖液－混勻－煮沸10－20min－－0.5mL接種小鼠

上清液+等量明膠磷酸鹽緩沖液-混勻－－0.5mL接種小鼠--死亡

上述結果：可判定檢樣中存在的毒素是肉毒毒素必要時要進行毒力測定及定型試驗。

存活21

（3）毒力測定（選做）

稀釋判定的上清液：50倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只500倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只5000倍－－注射小白鼠各兩只/0.5mL/只例：計算檢樣所注射5000倍稀釋液的動物全部存活，500倍的動物全部死亡，則可判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000MLD／mL－10000MLD／mL。

MLD：最小致死量或最小致死濃度(minimumlethaldoseMLC)系指藥物/毒物在最低劑量組的一群實驗動物中引起個別動物死亡的劑量和濃度

觀察4d--死亡存活情況判定毒力22（4）定型試驗（選做）

檢樣上清液＋等量A抗血清檢樣上清液＋等量B抗血清檢樣上清液＋等量C抗血清檢樣上清液＋等量D抗血清檢樣上清液＋等量E抗血清檢樣上清液＋等量F抗血清檢樣上清液＋等量G抗血清檢樣上清液+明膠磷酸鹽緩沖液混勻，37℃作用30min，各注射小鼠兩只，0.5mL/只，觀察4d,觀察結果。能保護動物免于發病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。檢樣上清液:用明膠磷酸鹽緩沖液適當稀釋檢樣的離心上清液23

注解①未經胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗；②為爭取時間盡快得出結果，毒素檢測的4項試驗也可同時進行；③根據具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型；④進行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應參照所用肉毒診斷血清的效價。⑤試驗動物的觀察可按陽性結果的出現隨時結束，以縮短觀察時間；唯有出現陰性結果時，應保留充分的觀察時間。/topic/mus-musculus242）肉毒梭菌檢出(增菌產毒培養試驗)

取庖肉培養基三支，煮沸10min一15min，做如下處理：

a)第一支：急速冷卻，接種檢樣均質液1ml一2ml；目的：檢測繁殖菌體；b)第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續于60℃保溫10min，急速冷卻目的：芽孢發芽

c)第三支：接種檢樣，繼續煮沸加熱10min，急速冷卻。目的：抑制其他雜菌25肉毒梭菌在庖肉培養基中生長：

培養基中含有葡萄糖和碎肉塊等，A、B型肉毒梭菌生長旺盛而且產大量氣體，表面渾濁，底有粉狀或顆粒狀沉淀，消化肉塊使其變黑有臭味。以上接種物于30℃厭氧培養5d，若無生長，可再培養10d。培養到期，若有生長，取培養液離心，以其上清液進行毒素檢測試驗，方法同前，陽性結果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。263）分離培養－菌體鑒定，需要時做卵黃瓊脂平板：取毒素檢測陽性的前述增菌產毒培養物接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養48h。肉毒梭菌菌落及周圍培養基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，是鑒別該菌較好的方法，但G型菌無此現象。是因為肉毒梭菌含脂肪酶，分解脂肪，產生甘油，使菌落及其周圍表面覆蓋著特有的彩虹樣(或珍珠層樣)薄層。毒素測定同前庖肉培養基庖肉培養基(3mL--10mL)各一支，分別在30及37℃下厭氧培養7d，按前述進行肉毒毒素檢測。

www.ahc-net.at/0001/antibiotika_monitor/4_00/4_00_3.htm27復習題