食品微生物學檢驗

大腸菌群計數

浙江工商大學趙廣英GB4789.3-2016食品安全國家標準

食品微生物學檢驗大腸菌群計數

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination

Enumerationofcoliforms

2016-12-23發布2010-06-23實施中華人民共和國衛生部發布前言本標準代替GB4789.3—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數》、GB/T4789.32—2002《食品衛生微生物學檢驗大腸菌群的快速檢測》和SN/T0169—2010《進出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測方法》大腸菌群計數部分。本標準與GB4789.3—2010相比,主要變化如下:——增加了檢驗原理;——修改了適用范圍;——修改了典型菌落的形態描述;——修改了第二法平板菌落數的選擇;——修改了第二法證實試驗;——修改了第二法平板計數的報告1范圍本標準規定了食品中大腸菌群（Coliforms）計數的方法。本標準第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數;第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數。

大腸桿菌(e-coli)2術語和定義

2.1大腸菌群（coliforms）:在一定培養條件下（基質、在36±1℃48h－96h）能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞（中小）桿菌。

（一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。）（加）*用途：該菌主要來源于人和溫血動物糞便，以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量；推斷食品中有否污染腸道致病菌（如霍亂、傷寒、痢疾等）的可能。為何選用大腸菌群作為食物和飲水被糞便污染的指標－指示菌？

－－因其符合作為指示菌的條件：

①來源只有腸道，且普遍而量多：②在外界生存條件和腸道致病菌相符或略長，但不在水中繁殖;③對消毒藥的抵抗力和腸道致病菌相符;④檢查方法比較簡單。還有什么菌可作為食物和飲水被糞便污染的指標菌？

－－產氣莢膜桿菌和糞鏈球菌可輔助證明，二者都是重要腸道正常菌群成員產氣莢膜桿菌：可在外界環境中形成芽胞，抵抗力強，存活時間長，對氯抵抗力強；檢測有氯消毒水的污染情況。糞鏈球菌：在自然環境中存活時間又較短。大腸菌群、產氣莢膜桿菌和糞鏈球菌三者都檢出說明食品新近被糞便所污染。2.2

最可能數mostprobablenumber，MPN:最可能數mostprobablenumber，MPN:基于泊松分布的一種間接計數方法。（加）泊松分布(Poissondistribution):（述昆蟲隨機分布型的數學表達公式。）一種概率分布，其特點是該分布的均值等于方差。適合于描述單位時間內隨機事件發生的次數。Siméon-DenisPoisson*在生態學中常用來描述隨機分布型的生物個體的空間分布格局。泊松分布是一種統計與概率學里常見到的離散概率分布，由法國數學家西莫恩·德尼·泊松（Siméon-DenisPoisson）在1838年發表。3檢驗原理3.1MPN法

MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養后,根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。

3.2平板計數法

大腸菌群在固體培養基中（結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）發酵乳糖產酸,在指示劑的作用下形成可計數的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環的菌落。4設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：3.1恒溫培養箱：36℃±1℃。······3.11菌落計數器

5培養基和試劑5.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1。5.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。5.3結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。5.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。5.5無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。5.6無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。5.7無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。5.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LaurylSulfateTryptose，LST）肉湯：見附錄A中A.1成分胰蛋白胨或胰酪胨

20.0g

氯化鈉5.0g

乳糖

（產酸產氣）

5.0g

磷酸氫二鉀

2.75g

磷酸二氫鉀2.75g

月桂基硫酸鈉*0.1g

蒸餾水1000.0mL

pH6.8±0.2*月桂基硫酸鈉（又稱十二烷基硫酸鈉/椰油醇（或月桂醇）硫酸鈉）：抑制非大腸菌群的細菌生長和修復已損傷的大腸菌群細胞的作用制法將上述成分溶解于蒸餾水中，調解pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL，121℃滅菌15min。

大腸桿菌在月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST)上典型特征

大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑：大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、月桂基/十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標準中乳糖膽鹽發酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產生影響，因此抑菌劑的添加應嚴格按照標準方法進行。5.2煌綠乳糖膽鹽（BrilliantGreenLactoseBile，BGLB）肉湯：見附錄A中A.2。

成分蛋白胨10.0g

乳糖

10.0g產酸產氣

牛膽粉溶液

200mL抑制G+菌

（oxgall或oxbile）

0.1%煌綠水溶液

13.3mL抑制非腸道桿菌蒸餾水800mL

pH7.2±0.1

大腸菌群在煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB）中生長制法

將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，PH7.0~7.5)用蒸餾水稀釋到975mL，調節pH至7.4，再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL，用蒸餾水補足到1000mL，用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL，121℃滅菌15min。5.3結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VioletRedBileAgar，VRBA）：見附錄A中A.3。成分蛋白胨

7.0g

酵母膏3.0g

乳糖10.0g產酸產氣氯化鈉5.0g

膽鹽或3號膽鹽

1.5g抑制雜菌中性紅0.03gpH6.8（紅）－8.0（黃）

結晶紫

0.002g抑制雜菌，特別是G＋菌瓊脂15~18g

蒸餾水1000.0mLpH7.4±0.1

大腸菌群在結晶紫中性紅瓊脂(VRBA)上的典型特征

5.4磷酸鹽緩沖液：見附錄A中A.4。5.5無菌生理鹽水：見附錄A中A.5。5.6無菌1mol/LNaOH：見附錄A中A.6。5.7無菌1mol/LHCl：見附錄A中A.7。歡迎專家蒞臨指導！食品安全國家標準

食品微生物學檢驗大腸菌群計數

Nationalfoodsafetystandard

Foodmicrobiologicalexamination

Enumerationofcoliforms

2016-12-23發布2010-06-23實施中華人民共和國衛生部發布第一法大腸菌群MPN計數法

6檢驗程序大腸菌群MPN計數的檢驗程序見圖1。初發酵試驗；選擇性增菌。月桂基硫酸鹽胰蛋白胨3個×3管×1mL24h-適用于含目的菌量較少的樣品；續圖1復發酵試驗；選擇性更強。一環接種煌綠乳糖膽鹽（見附錄B）總耗時3-4d.7操作步驟

7.1樣品的稀釋7.1.1固體和半固體樣品：稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,8000r/min～10000r/min均質1min～2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。7.1.2液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。7.1.3

樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調節。7.1.4

用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。7.1.5

根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。7.2初發酵試驗每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯），36℃±1℃培養24h±2h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24h±2h產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續培養至48h±2h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。7.3復發酵試驗：用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36℃±1℃培養48h±2h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。7.4大腸菌群最可能數（MPN）的報告：按6.3確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。附錄B第二法大腸菌群平板計數法：8檢驗程序大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖2。2－3d大腸菌群在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂上的典型菌落煌綠乳糖膽鹽肉湯選擇性鑒別培養基：結晶紫中性紅膽鹽瓊脂；2個平皿*2-3稀釋度*1mL=4-6個平皿證實試驗：10個菌落接種10管肉湯9操作步驟9.1樣品的稀釋按6.1進行。9.2平板計數9.2.1選取2個～3個適宜的連續稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。9.2.2及時將15mL～20mL冷至46℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3mL～4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36℃±1℃培養18h～24h。9.4證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養24h～48h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。9.3平板菌落數的選擇選取菌落數在15