正弦波振動對制動大鼠肌肉萎縮的對抗作用

由于運動減少、剎車或肌肉負荷，骨骼明顯減少，肌肉和橫截面積顯著變化。這種變化對提高人體技能、恢復效率和肌肉壽命產生了深遠的影響。因此,隨著我國體育事業的發展,尋找和制定更為安全有效的防護措施具有重要意義。肌梭的傳入放電減少是廢用性肌萎縮發生的重要原因之一。因此我們推論,如某種方法可以使肌梭的傳入增強,則在理論上能夠對抗廢用性肌萎縮。研究表明,高頻正弦波振動(HFV)可以選擇性地興奮肌梭。為此,我們以大鼠后肢伸長位制動為廢用動物模型,采用短時間歇式振動的方法,結合免疫組化染色法檢測,觀察50Hz、200Hz和400HzHFV對制動大鼠比目魚肌(SOL)濕重體重比、肌纖維橫截面積、梭外肌纖維的構成比以及梭內肌纖維MHC表達的影響,探討其對廢用性肌萎縮的對抗作用,為尋找預防和治療廢用性肌萎縮的有效措施提供資料。1研究對象和方法1.1動物分組及制動將健康雌性Sprague-Dawley品系大鼠按體重配對原則分為5組(西安交大醫學院實驗動物中心提供,體重為230～240g,每組7只動物):正常同步對照組(CON),制動(IMM)14天組,制動+50Hz振動(IMM+50HzHFV)14天組,制動+200Hz振動(IMM+100HzHFV)14天組,制動+400Hz振動(IMM+200HzHFV)14天組。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。1.2下肢墊材料應用傳統模型并加以改進:將大鼠進行腹腔麻醉,在大鼠左后肢的彎曲部位(神經和血管較為密集且易受壓位置)墊以棉層,最終用石膏繃帶包扎動物后肢,將其固定在踝關節背伸(約45°)而膝關節伸展(約180°)位,使SOL處于伸長位。1.3融合400hz在SOL肌腹部位采取短時多次的間歇式振動方法進行振動(50Hz、200Hz和400Hz,300μm,14天)。振動刺激詳盡環節如下:每振動1min后間歇1min,重復4次后間歇2min,此為一個振動周期,一個振動點每周期振動時間總計4min(不包括間歇時間),每次重復振動3個周期,每天進行4次振動。1.4石蠟切片和抗體的確定將大鼠進行腹腔麻醉,稱體重后經升主動脈行血管灌注固定。灌注后立即取出大鼠左下肢SOL,稱重并剪修肌肉(以100g體重標化計算比目魚肌濕重體重比,MWW/BW),然后浸于多聚甲醛固定液(40g/L,4℃)中過夜,以垂直位行石蠟包埋。石蠟切片以接近肌腹的橫截面(厚度為5μm)為優選。研究采取抗快縮型MHC抗體(一抗為MY-32,購自Sigma公司;二抗為抗小鼠IgG,購自Vector公司),參照傳統ABC法進行免疫組化染色。1.5單因素方差分析實驗應用Image-ProPLUS圖象分析系統(MEDIACYBERNETICS)對各型肌纖維的細胞數進行定量分析,測定每個視野內各型肌纖維數,并計算各型肌纖維的構成比和肌纖維的橫截面積(CSA),求出每組動物的均值。實驗數據采用SPSS10.0軟件中的單因素方差分析法(ANOVA)進行統計分析。實驗結果以均數±標準差(X±S)表示,取P<0.05作為統計學差異的界值。2結果2.1各肌纖維均為肌肉結構的變化大鼠行制動實驗14天后,梭外肌快縮型MHC的表達與CON組相比有所增強,SOL肌纖維的構成比有明顯改變,Ⅰ型肌纖維(慢肌)的構成比減少,由86%減少到70%,Ⅱ型肌纖維(快肌)的構成比增加,由14%增加到30%,IMM組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比均有所下降,與CON組對比有顯著性差異(P<0.05)。這表明制動使SOL有了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。IMM組SOL梭外肌纖維結構特征:肌束狀結構紊亂,肌纖維間隙加大,肌內膜下結締組織大量增生,有呈病灶性表現的傾向。振動組與IMM組的染色結果相比,Ⅰ型肌纖維的構成比明顯上升,同時Ⅱ型肌纖維的構成比明顯下降(P<0.05),其中以IMM+200HzHFV組的變化最為明顯。振動組I、II型肌纖維的平均橫截面積以及比目魚肌濕重體重比與CON組對比均有所下降,但無顯著性差異(P>0.05,見表1)。結果提示,在制動期間對大鼠施加HFV可以對抗因制動而引起的梭外慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。2.2imm對大鼠sol肌梭結構的影響在CON組SOL肌梭的染色結果可以觀察到:核袋Ⅰ纖維內無著色沉淀(陰性肌纖維);核袋Ⅱ纖維多無著色沉淀(陰性肌纖維),少數有淺褐色沉淀(弱陽性肌纖維);而核鏈纖維內則出現棕色沉淀(陽性肌纖維)。CON組SOL肌梭結構特征:被囊膜完整,軸周間隙結構正常,核袋和核鏈纖維區分明顯。在IMM組SOL肌梭的染色結果可以觀察到:核袋Ⅰ纖維內依然無著色沉淀(陰性肌纖維);核袋Ⅱ纖維多有褐色沉淀(陽性肌纖維);而核鏈纖維內則出現深棕色沉淀(強陽性肌纖維)。這表明制動使梭內肌呈現了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。IMM組大鼠SOL肌梭結構特征:梭內肌破壞嚴重,部分肌膜溶解消失,軸周間隙增寬,內囊壁部分腫脹溶解。振動組大鼠梭內肌纖維著色及顯微結構的變化近于正常而無顯著的病灶傾向(見圖1)。結果提示,在制動期間對大鼠施加HFV可以對抗因制動而引起的梭內慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。3肌梭的發生和肌梭類型的變化MHC是骨骼肌纖維中最重要的肌原纖維蛋白之一,含有與肌肉收縮速度有關的酶活性,維持肌細胞結構的完整性。骨骼肌纖維至少表達6種表型的MHC:MHCⅠ/betacardiacMHC;MHCⅡa;MHCⅡb;MHCⅡd/x;MHCembryonic;MHCfetal/neonatal,其表型的變化必然會影響肌纖維的代謝和功能特性。本實驗選用以兔的快肌纖維作為免疫源而得到的MHC抗體僅檢測快肌MHC的一個表位,可以同梭內、外肌纖維中快肌纖維的所有亞型發生免疫反應,同慢肌則不發生反應。研究表明,在廢用狀態下,SOL(典型慢肌)會發生明顯的萎縮,慢氧化型纖維數量明顯減少,而中間型、快氧化型和酵解型纖維數量卻增加。我們的實驗結果與前期的文獻報道一致:廢用14天后,SOL梭外肌纖維MHC的表達水平和表型發生了改變,Ⅰ型肌纖維的構成比明顯減少,Ⅱ型肌纖維的構成比明顯增加,出現了Ⅰ型肌纖維向Ⅱ型肌纖維轉化的趨勢。肌梭與骨骼肌在發生學上有著相同的起源與血供來源,與梭外肌為同一反射弧的不同部分。核袋Ⅰ纖維的代謝特點類似慢肌,而核袋Ⅱ纖維和核鏈纖維則類似快肌。國外學者曾經發現肌肉制動不但可引起肌肉本體感受器的傳入沖動減少,而且肌梭的核袋和核鏈纖維的橫截面積也會相應減少。本研究結果顯示:廢用14天后,SOL肌梭的核袋Ⅰ纖維中MHC的表達仍呈陰性,核袋Ⅱ纖維出現由陰性向陽性的轉化,核鏈纖維MHC的表達有所增強,這表明制動使梭內肌呈現了慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢。將HFV作為外界機械刺激可以提高肌梭的興奮性,使肌梭的傳入放電活動增強,因此HFV常作為一種肌梭敏感性的研究手段,但其作為廢用性肌萎縮的對抗措施卻少見研究。國外學者發現,對大鼠跟腱施以120Hz的HFV,可以明顯地對抗大鼠失重性肌萎縮的癥狀。另有研究證實,振動動物的肌肉可以使其初級傳入末梢的興奮性增強,而且還能夠增強其某些次級傳入末梢的興奮性,而振動肌腱則僅限于對初級傳入末梢興奮性的增強。因此,考慮到能夠更大程度地興奮肌梭,我們所采用的振動部位與前者有所不同,即由肌腱轉為了肌腹。我室前期研究發現,這種肌肉振動方法對制動引起的廢用性肌萎縮的具有一定的對抗作用,可使肌梭的傳入沖動增加,可以減緩制動大鼠SOL肌纖維橫截面積和濕重體重比的減少趨勢。本次MHC染色結果顯示,在大鼠制動期間給予HFV后,SOL梭外肌Ⅰ型肌纖維的構成比明顯上升,同時Ⅱ型肌纖維的構成比明顯下降,其中以IMM+200HzHFV組的變化最為明顯。振動組SOL梭內肌纖維中MHC表達及顯微結構的改變均不明顯,接近于正常大鼠。結果提示,在制動期間對大鼠施加HFV可以有效地對抗因制動而引起的梭內、外慢肌纖維向快肌纖維的轉化趨勢,這與前期的研究結果是一致的;而相對于50Hz和400Hz的HFV,肌梭對于200Hz的振動可能更為敏感。從以上方面分析,我們認為,HFV對于廢用性肌萎縮具有對抗作用,根本原因是由于HFV對肌梭興奮性的誘發作用。推測其機制為:HFV誘使肌梭的Ia類和Ⅱ類傳入纖維的興奮性增強,加大了肌梭傳向中樞的傳入沖