08100049毒理學實驗一、魚的急性毒性實驗背景知識急性毒性實驗的主要目的是確定化學物質的毒性程度、劑量―反應關系，根據待測化學物質與其它已知毒性化學物質的相對毒性,推定具體的理化性質，測定其急性毒作用,以及提供毒作用模型方面的資料。此外,這種研究也能指出化學物質可能的靶器官及其特異性毒作用,并對亞慢性毒性試驗研究中所用劑量提供指南。外源化合物的毒作用往往通過某一染毒持續時間的半致死量/濃度(LD50/LC50),或化學物質在空氣中某一染毒濃度的半致死時間(LT50)，或用半數效應量(ED50或(EC50)來估計表示（注：化學物質在水中濃度對水生生物如無脊椎動物、魚蝦的死亡不易鑒別時使用）。水生生物的急性毒性試驗廣泛應用于水域環境污染監測工作中,對控制工業廢水的排放，保護水域環境，制定水質標準，發展水產品的生產，具有重大意義。受試生物的急性實驗有下列四種方式進行暴露試驗即靜態、循環、更新、動態,但最常用的方法是靜態與動態方法。可提供下列的觀測指標：①估計產生毒性作用的上限濃度，②估計不同種的水生生物對受試物的相對敏感性，③估計大量受試物的相對毒性，④估計水質對受試物毒性的影響(pH、溶解氧、鹽度、硬度、懸浮物)。⑤得出濃度―反應關系曲線及暴露時間的意義,動態實驗可提高保持令人滿意的實驗條件的能力,而且沒有時間的限制。因此它能給出暴露時間―反應關系比較完美的估計。水生生物的急性毒性的實驗應當設計成為能得到計數標準的反應(有或無,生與死)，受試污染物濃度與暴露生物中受影響生物的百分比之間的關系，可畫出濃度―死亡率曲線。急性實驗結果可表示每一實驗濃度中死亡或不動生物的百分比;從觀察內插法或計算中得出LC50，或EC50及相應的95%的置信區間。實驗目的本實驗通過觀察在不同受試物濃度處理下，魚的急性中毒表現和經過，了解和基本掌握測定毒物的半數致死劑量/濃度（LD50/LC50）的方法，了解受試物劑量和生物反應的關系及計算表示方法。實驗原理魚類對水環境的變化反應十分靈敏，魚類毒性試驗在研究水污染及水環境質量中占重要地位。當水體中的污染物達到一定程度時，就會引起一系列中毒反應，例如行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變、直至死亡。在規定的條件下，使魚接觸含不同濃度受試物的水溶液，實驗至少進行24h，最好以96h為一個實驗周期，在24h、48h．72h、96h時記錄實驗魚的死亡率，確定魚類死亡50％時的受試物濃度。本實驗將經過曝氣馴化的魚（保證其初始狀態一致），放入不同濃度的重鉻酸鉀溶液中進行96hr的觀察，記錄不同濃度組6、24、48、72和96hr的魚的死亡率，得出劑量-死亡率曲線，求出不同時間的LC50。通過魚類急性毒性試驗可以評價受試物對水生生物可能產生的影響，以短期暴露效應表明受試物的毒害性。魚類急性毒性試驗不僅用于測定化學物質毒性強度、測定水體污染程度、檢查廢水處理的有效程度，也為制定水質標準、評價環境質量和管理廢水排放提供環境依據。實驗材料與方法1.實驗材料：1）待測化學物：使用實驗室劑---重鉻酸鉀溶液K2Cr2O7（Cr6+,2000mg/L）溶液。配制一系列的濃度梯度溶液，本試驗的濃度梯度為四個濃度梯度和一個空白對照，即150，100，63、39、0（mg/L）。每組三個同學，自己配制不同濃度系列的重鉻酸鉀溶液：2)實驗動物：野生石紋魚，金魚等（從魚市購買）：用曝氣后的自來水馴養3天，補充氧氣以保證溶解氧的濃度。2.實驗條件及處理：靜態方法1） 預試驗：一般用3~5個動物,用對數比例形成的系列濃度,如0.01,0.1,1,10,l00ppm,同時做一對照（如受試物為廢水,采用體積百分比濃度,如0.01,01,1,10,100%)從中尋找理想的范圍.因為時間限制，本實驗學生不做預試驗。2）正式試驗：計算并配制重鉻酸鉀系列濃度的溶液，選擇健康的魚，放入不同濃度的0、39、63、100和150mg/L的重鉻酸鉀溶液中，每個濃度的魚缸里加入10條魚，設1～3個平行。經過6，24，48，72，96小時后，在24h、48h、72h、96h后檢查受試魚的狀況。如果沒有任何肉眼可見的運動，如鰓的扇動、碰觸尾柄后無反應等，即可判斷該魚已死亡，觀察并記錄死魚數目后，觀察記錄死亡魚的數量并將死亡個體挑出。應在試驗開始后6h觀察各處理組魚的狀況，并記錄試驗魚的異常行為（如魚體側翻、失去平衡，游泳能力和呼吸能力減弱，色素沉積等）。（理論上試驗開始和結束時要測定pH、溶解氧和溫度。試驗期間，每天至少測定一次。至少在試驗開始和結束時，測定實驗容器中試驗液的受試物濃度）試驗結束時，對照組的死亡率不得超過10％。結果與討論1．數據處理1）以暴露濃度為橫坐標，死亡率為縱坐標，在計算機或對數概率紙上，繪制暴露濃度對死亡率的曲線。用直線內插法或常用統計程序計算出6h、24h、48h、72h、96h的半致死濃度（LC50）值，并計算95％的置信限。如果試驗數據不適于計算LC50，可用不引起死亡的最高濃度和引起100％死亡的最低死亡濃度估算LC50的近似值，即這兩個濃度的幾何平均值。（√Lmax*Dmin）2）實驗開始后24h、48h、72h、96h時的LC50的值，并進行毒性分級評價（見附錄）。3）實驗報告包括實驗目的、材料、方法、步驟、結果，并對結果進行討論。附錄魚類急性毒性實驗毒性分級標準魚起始LC50（mg/L）毒性分級＜1劇毒1～100高毒10